(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210190570.6 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 张桂红　高琦　冯永智　龚浪　 王衡　郑泽中　蔡孟楷　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒的双 重荧光定量PCR检测引物和探 针及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲 猪瘟病毒的双重荧光定量PCR检测引物和探针及 试剂盒， 所述双重荧光定量PCR检测引物核苷酸 序列如SEQ  ID NO:1～2和4～5 所示。 并进 一步建 立了检测方法和检测试剂盒。 该方法特异性强， 与其他病毒无交叉反应； 灵敏度高， 最低检测拷 贝数分别为1.07 ×102copies/μL和3.13 × 104copies/μL； 重复性好， Ct值变异系数均小于 2％； 应用该方法与OIE推荐 的荧光定量PCR方法 检测结果一致。 本发明建立的双重荧光定量PCR 为鉴别基因I型和II型ASFV提供了快速检测方 法， 有利于完善中国针对ASF制定的高效防控措 施。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图5页 CN 114592090 A 2022.06.07 CN 114592090 A 1.一种鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测引物， 其特征在于， 其核 苷酸序列如SEQ  ID NO:1～2和4～5所示。 2.一种鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测引物和探针的组合物， 其 特征在于， 含有权利要求1所述的荧 光定量PCR检测引物。 3.根据权利 要求2所述的组合物， 其特征在于， 还含有核苷酸序列如SEQ  ID NO:3和6所 示的探针。 4.根据权利 要求3所述的组合物， 其特征在于， 核苷酸序列如SEQ  ID NO:3和6所示的探 针5’端修饰不同的荧 光基团， 3 ’端修饰不同的淬灭基团。 5.根据权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示的探针 5’端修饰荧光基团FAM， 3 ’端修饰淬灭基团MGB； 核苷 酸序列如SEQ  ID NO:6所示的探针5 ’端 修饰荧光基团HEX， 3’端修饰淬灭基团BHQ1。 6.权利要求1所述的荧光定量PCR检测引物在制备鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒的 试剂盒中的应用。 7.权利要求2到5任一所述的组合物在制备鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病 毒的试剂 盒 中的应用。 8.一种鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 含有权利要求1所述 的荧光定量PCR检测引物或权利要求2到 5任一所述的组合物。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 含有荧光定量PCR试剂和/水。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光定量PCR试剂为2 ×AceQ  Universal U+Probe Master Mix V2。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592090 A 2一种鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒 的双重荧光定量PCR检 测引物和探针及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及非洲猪瘟的检测技术领域， 具体地， 涉及一种鉴别基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲 猪瘟病毒的双重荧 光定量PCR检测引物和探针及试剂盒。 背景技术 [0002]非洲猪瘟(Afr ican swine fever， ASF)是由非洲猪瘟病毒(Afr ican swine fever  virus， ASFV)引起猪的一种急性、 致死性的高度接触性传染病。 其临床特征为高热、 皮肤发 绀以及淋巴结和内脏器官的严重出血等， 死亡率高达100％。 1921年， ASF首次在东 非肯尼亚 被报道， ASFV根据编码主要衣壳蛋 白p72的B646L基因的3'端序列被分为24个基因型。 在最 初的几十年里， 多种基因型的ASFV一直在非洲地区流行， 直到1957年， 基因 Ⅰ型第一次在非 洲以外的葡萄牙被发现， 并相继在欧洲、 南美洲、 加勒比群岛、 西非、 东非和南部非洲被报 道。 2007年， 基因 Ⅱ型从非洲东南部 蔓延至俄罗斯的高加索地区， 之后在欧洲、 亚洲、 南美洲 等30多个国家和地区流行， 给这些国家的养猪业造成了巨大的经济损失。 [0003]自2018年8月基因 Ⅱ型ASFV传入中国以来， 中国各地出现了ASFV大规模的爆发， 2020年8月， 本实验室在猪只体内首次检测并分离得到基因 Ⅰ型ASFV， 此后两种低毒力但 高 效传播的基因 Ⅰ型ASFV也在中国被报道， 这使 得ASF疾病的诊断和防控 更具挑战性。 因此， 在 制定任何严格的防控 策略前， 区分基因 Ⅰ型和基因 Ⅱ型ASFV是必 要的检测基础。 由于 当前市 面上没有针对ASF的有效疫苗， 因此该疾病的控制依赖于生物安全防控、 快速检测和受感染 动物的扑杀。 目前， 有许多分子和血清学方法可用于鉴定感染ASFV的动物， 血清学检测用于 确定动物是否接触过ASFV， 分子检测可以在出现临床症状之前检测到猪体内是否存在 ASFV， PCR和ELISA检测方法是检测抗原或抗体的主要常规诊断方法(Abad  et al.,1998； Fernández et al.,2013； King  et al.,2003； Tignon  et al.,2011)。 世界动物卫生组织 (OIE)建议使用经过验证的荧光定量PCR方法来诊断ASF(Fern ández et al.,2013； King  et  al.,2003； AgüEro et al.,2003)， 与传统PCR相比， 荧光定量PCR具有快速性、 高度敏 感性和 特异性(Fern ández et al.,2013； King  et al.,2003)。 当前市场上已开发并验证了多种用 于ASFV检测的荧光定量PCR诊断方法， 其中大多数是针对B646L基因(Fern ándezet al., 2013； Tignon  et al.,2011； Wang  et al.,2020； Wang  et al.,2020； Zsak  et al.,2006)， 仅用于ASFV阳性感染的检测。 并不能有效地区分基因 Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒。 [0004]有研究表明， 除了编码蛋白p72的B646L基因外， B602L基因内的中央可变区(CVR) 的串联重复序列(TRS)(Gallardo  et al.,2009； Lubibi  et al.,2009； Nix  et al.,2020) 和编码p54蛋白的E18 3L基因同样是ASF分子流行病学中研究ASFV毒株基因型多样性的靶标 基因， 通过结合B646L、 E183L和pB602L基因序列， 可为ASFV病毒的分型提供更多的数据 支撑 (Gallardo  et al.,2009； Basto s et al.,2004； Wilkinson  et al.,2000)。 还有研究表明， 检测E183L基因序列是一种有价值的附加基因分型方法， 可用于鉴别基因 Ⅰ型ASFV的分子流 行病学研究(Carmina  et al.,2009)。 但以上研究均为使用基因的测序方法， 结合基因的序说　明　书 1/11 页 3 CN 114592090 A 3