(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210189653.3 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 山东农业大 学 地址 271018 山 东省泰安市泰山区岱宗大 街61号 (72)发明人 成子强　李佳琛　周德方　严天行　 刘圣龙　赵钰莹　 (74)专利代理 机构 山东祺智知识产权代理有限 公司 373 61 专利代理师 赵斌 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan 荧光定量PCR试剂盒 (57)摘要 本发明属于病毒检测领域， 具体提供了一种 同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量 PCR试剂盒， 其中整 合了鸡传染性贫血病毒(CAV) 的正向引物、 反向引物和特异性荧光探针； 圆圈 病毒禽源1型(Gyrovirus  galga1， GyG1)的正向 引物、 反向引物和特异性荧光探针； 圆圈病毒人 源1型(Gyrovirushomsa1,GyH1)的正向引物、 反 向引物和特异性荧光探针； 采用上述组成的试剂 盒具备高灵敏性、 高特异性、 低污染和实时检测 的优势， 为畜禽养殖场临床圆圈病毒病的早期 诊 断、 监测预警和防治， 及动物食品安全检验提供 可靠的技 术和产品。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图5页 CN 114592089 A 2022.06.07 CN 114592089 A 1.一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于： 所述的 试剂盒中包 含有： 用于检测鸡传染性贫血病毒的引物和探针序列如下 所示： 正向引物： G GTGTTCAGGCCACCAACAA； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 反向引物： GCAGATCT TAGCGTGGGAGC； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 探针： TATCGCTGTGTG GCTGCGCGA ATGC； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 用于检测圆圈病毒禽源1型的引物和探针序列如下 所示： 正向引物： A AAGGTGCACCGCCTATGTG； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 反向引物： GAT TCACCGGTAGCCACTGC； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 探针： TACG GCAACGTGGAGTCGAACGCTCCA； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 用于检测圆圈病毒人源1型的引物和探针序列如下 所示： 正向引物： GTCG GTTGGGACTCTCTC CA； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 反向引物： G GAACCAGTGGCGTCTGA AG； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 探针： TTCCTGGCTTCGCGAGTGT TCGCGT； 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示。 2.根据权利要求1所述的三重TaqMan 荧光定量PCR试剂盒， 其特 征在于： 试剂盒中还含有还含有荧光定量PCR反应液、 标准阳性模板和阴性对照样品； 所述阴性 对照样品为无RNA酶双蒸水。 3.根据权利要求2所述的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于： 所述标准阳性 模包括CAV标准品、 GyG1标准品和GyH1标准品， 三 者分别为： CAV标准品为克隆构建的编号为pMD ‑19T‑CAV重组质粒， pMD ‑19T‑CAV重组克隆质粒含 有所述反应液中CA V引物的扩增产物的目标核酸序列； GyG1标准 品为克隆构建的编号为pMD ‑19T‑GyG1重组质粒， pMD ‑19T‑GyG1重组克隆质粒 含有所述反应液中GyG1引物的扩增产物的目标核酸序列； GyH1标准 品为克隆构建的编号为pMD ‑19T‑GyH1重组质粒， pMD ‑19T‑GyH1重组克隆质粒 含有所述反应液中GyH1引物的扩增产物的目标核酸序列。 4.根据权利要求2所述的三重TaqMan 荧光定量PCR试剂盒， 其特 征在于： 荧光定量PCR反应液为20 μL， 具体组成如下： 2×Premix Ex Taq(Probe  qPCR)10μL， CAV、 GyG1和GyH1正反向引物各0.4μL， 探针各 0.8 μL， DNA模板1 μL， 加无DNA/RNA酶双蒸水至反应 体系总体积为20 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592089 A 2一种同时检测三种圆圈病毒 的三重TaqMa n荧光定量PCR试 剂盒 技术领域 [0001]本发明属于病毒检测领域， 具体提供了一种同时检测三种圆圈病毒的三重   TaqMan荧光定量PCR试剂盒。 背景技术 [0002]圆圈病毒Gyrovirus为单链环状DNA病毒， 该病毒属曾经属于圆环病毒科   (Circoviridae)， 由于圆圈病毒在结构上和遗传信息上均与细 环病毒科  (Anelloviridae) 成员更加相似， 因此2016年国际病毒分类委员会批准的最新病毒分类 法， Gyrovirus被重新 分配到细环病毒科家族。 圆圈病毒属可以分为三个分支， 其中鸡传染性贫血病毒(CAV)、 圆 圈病毒禽源1型(GyG1)和圆圈病毒人源1型(GyH1)同属于A分支。 [0003]其中鸡传染性贫血病毒(Chicken  infectious anaemia virus， CAV)呈六角形， 有 的病毒粒子也呈球形， 平均粒子大小约25nm， 无囊膜。 CAV可引起没有母源抗体保护的幼龄 鸡的致死性临床症状和成年鸡的亚临床症状， 同时造成严重的免疫抑制， 因此加重其他细 菌和病毒感染的严重程度并影响其他病原体疫苗接种的效果， 从而在 全球范围内给家禽业 造成巨大的经济损失。 无母源抗体的青年鸡感染CAV的临床特征包括精神沉郁、 显著的体重 下降(生长发育不良)、 肌肉出血、 皮下出血( “蓝翅病”)、 严重贫血和骨髓发育不全， 偶见坏 疽性皮炎。 临床中与CAV密切相关的综合征包括出血综合征、 贫血皮炎综合征或蓝翅病。 感 染CAV最常见的大体病变是胸腺和骨髓 萎缩， 胸腺小叶体积 显著减小甚至完全缺如， 呈深红 色， 股骨骨髓变成黄色或淡粉色。 贫血雏鸡的组织病理学特征是全骨髓再生障碍和全身淋 巴组织萎缩。 CAV的主要靶细胞是成红细胞和淋巴细胞前体细胞。 骨髓中的造血细胞遭到破 坏， 从而使红细胞和髓细胞的数量急剧减少， 这是导致贫血和免疫抑制的主要原因。 CAV目 前只有一种血清型， 可通过 水平和垂直传播感染所有年龄和类型的鸡， 呈世界性 地流行。 [0004]圆圈病毒禽源1型(Gyrovirus  galga1， GyG1)发现于2011年。 研究人员分别 在巴西 患病鸡血清和法国健康志愿者皮肤拭子样品中相继独立鉴定并命名了禽圆圈病毒2型 (Avian gyrovirus  2， AGV2)和人 圆圈病毒(Human  gyrovirus,  HGyV)， 后鉴于两种病毒蛋 白编码序列的高度同源性(93 ‑97％)， 借鉴圆环病毒属物种分界阈值80％全基因组核苷酸 序列一致的分界规则， 将其视为同种病毒。 此后， 在世界范围内的不同样 品中检测 到HGyV/ GyG1的存在， 这些样品包括人类、 雪貂、 王锦蛇、 家猫。 在巴西35种商品化疫苗中检测到CAV (7/35)和  GyG1(9/32)的污染， 其中包括使用SPF鸡胚或原代成纤维细胞制作的活疫苗， 这 给行业人员造成极大的不安， 但研究者在巴西出口导向的高密度商品代肉鸡场的正常鸡粪 便病毒组中发现一系列单链环状DNA病毒， 其中包括GyG1， 2021  年国际病毒委员会重新将 其命名为圆圈病毒禽源1型。 [0005]圆圈病毒人源1型(Gyrovirus  homsa1,GyH1)2012年发现于智利的腹泻的儿童， 2018年发现于传染性病毒 性腺胃炎(Tran smissible viral proventricu litis， TVP)病鸡。 TVP主要引起鸡的吸收不良综合征、 粪便过料综合征和发育不全综合征。 该病能够显著降低说　明　书 1/9 页 3 CN 114592089 A 3