(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210185587.2 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 成都纳比微特检测技 术服务有限公 司 地址 610200 四川省成 都市天府新区万 安 镇麓山大道二段19号附1号2栋1层2 号、 3号 申请人 成都纳比生物科技有限公司 (72)发明人 余树芳　袁旦一　陈斌　何谦　 辜良斌　李晓琪　张丹　 (74)专利代理 机构 重庆乐泰知识产权代理事务 所(普通合伙) 50221 代理人 林慰敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 SRSF5结合蛋白的PCR检测试剂盒及检测方 法 (57)摘要 本发明属于流感病毒检测技术领域， 具体 的， 涉及一种流感病毒生命周期中与病毒RNA相 互作用的关键RNA结合蛋白SRSF5的PCR检测试剂 盒及检测方法。 现有实时荧光定量PCR技术在检 测流感病毒时通常是检测流 感病毒本身， 对感染 的宿主的相关检测较少， 还未见有检测宿主细胞 中SRSF5结合蛋白的PCR技术， 为此， 本发明提供 了一种流感病毒生命周期中关键RNA结合蛋白 SRSF5的实时荧光定量PCR检测试剂盒， 通过相对 定量检测与流感病毒密切相关的宿主体内的 SRSF5结合蛋白， 来判断机体内的流感感染情况。 本发明的检测试剂盒准确性好， 灵敏度好， 不易 受到流感病毒突变的影响， 适宜 推广使用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 CN 114317836 A 2022.04.12 CN 114317836 A 1.SRSF5结合蛋白的PCR检测试剂盒， 其特征在于： 包括上游引物SRSF5 ‑F和下游引物 SRSF5‑R， 核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2所示。 2.根据权利要求1所述的SRSF5结合蛋白的PCR检测试剂盒， 其特征在于： 试剂盒还包 括： Green Realtime  PCR Master Mix， 模板 cDNA和无菌水。 3.根据权利要求2所述的SRSF5结合蛋白的PCR检测试剂盒， 其特征在于： 所述的 Green Realtime  PCR Master Mix的组成包括： dNTPs、 MgCl2、 Taq DNA多聚酶、 抗 Taq单克隆抗体。 4.根据权利要求2所述的SRSF5结合蛋白的PCR检测试剂盒， 其特征在于： 具体的组成 为： 每20uL反应液中包含了： Green Realtime  PCR Master Mix 10μL， 上游引物 0.8‑1.0 μL， 下游引物0.8 ‑1.0 μL， 模板RNA  2.0‑3.0 μL， 余量为无菌水； 所述上游引物和下游 引物的浓度均为10pmo l/ μL。 5.权利要求1 ‑4任一项所述的SRSF5结合蛋白的实时荧光定量PCR检测方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： a、 用RNA提取 试剂盒从待检样品中提取RNA； b、 将提取的RNA与流感病毒生命周期中关键RNA结合蛋白SRSF5的实时荧光定量PCR检 测试剂盒中的试剂混合， 进行qPCR反应； c、 反应结束后及时进行 结果判读。 6.根据权利 要求5所述的SRSF5结合 蛋白的实时荧光定量PCR检测方法， 其特征在于： 步 骤a中所述的待检样品包括： 宿主的血 液或组织样品。 7.根据权利 要求5所述的SRSF5结合 蛋白的实时荧光定量PCR检测方法， 其特征在于： 步 骤b所述的qPCR反应 的条件为： 55℃15min； 95℃30s； 95℃10s； 60℃30s后两步进行40个循 环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317836 A 2SRSF5结合蛋白的PCR检测试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于流感病毒检测技术领域， 具体 的， 涉及一种流感病毒生命周期中与病 毒RNA相互作用的关键RNA结合蛋白SRSF5的PCR检测试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]流感病毒是一种具有高度传染性的人畜共患病病原， 在世界范围内具有较高的发 病率和死亡率， 对全球的公共卫生安全造成了较为严重的威胁。 目前控制世界各地季节性 流感疫情爆发的唯一方法是疫苗， 但由于流感病毒毒株经常变异， 导致抗原表位预测和疫 苗生产相对滞后， 从而影响了疫苗的有效使用。 宿主感染病毒后其先天免疫系统被激活以 限制病毒复制和清除病原体， 随后宿 主获得性免疫参与特异 性病毒清除。 另外， 病毒也通过 多种策略避免被宿主免疫识别和 消除。 [0003]流感病毒属于正黏病毒科， 是一种能够感染人、 禽、 猪和犬， 甚至是鲸鱼、 貂和海豹 等的有囊膜结构、 分节段的负链RNA病毒。 流感病毒根据M和NP抗原性的不同又可分为甲 (A)、 乙(B)、 丙(C)三型， 以及近年来新发现的丁型(D)， 这四种 类型的流感病毒具有不同的 致病性和宿主范 围。 目前， 以甲型流感病毒(Influenza  A virus， IAV)的危害最大、 流行也 最为广泛， 因为它不仅能够给畜禽养殖业带来巨大 的经济损失， 而且能够跨物种传播感染 并致死哺乳动物， 全世界每年因流感病毒感染导致的死亡人数在29万到65万之间， 这给公 共卫生安全带来极大的威胁。 另外， 在免疫压力的作用下流感病毒的抗原性不断发生变异， 从而逃逸宿 主的免疫监视， 产生新的流行毒株。 近年来,多种禽流感病毒的出现及其在世界 范围内的流行,导致人感染禽流感病毒的病例增加,加剧了禽流感病毒的公共卫生学危害， 特别是H5、 H7和H9亚型。 [0004]由于流感病毒经常变异， 导致抗原表位预测和疫苗生产相对滞后， 从而影响了疫 苗的有效使用。 此外， 一些抗病毒药物的使用， 包括金刚烷胺和神经氨酸酶抑制剂等， 导致 禽流感病毒的耐药性正在不断增强。 由于流感病毒需要利用宿主的转录翻译系统进行复 制， 所以宿主蛋白在流感病毒维持其 生命周期及致病性中具有非常重要的作用。 [0005]实时荧光定量PCR技术是美国Applied  Biosystems公司在1996年研发出来的一种 新技术， 此种技术不但能够解决P CR污染的问题， 还具有较高的自动化程度以及较强的特异 性。 采用此种技术对流感病毒进 行检测诊断时， 由于将实时P CR技术与逆转录技术结合了起 来， 因此被叫做定量 “RT‑PCR”技术。 结合起来的这种技术能够用少量的RNA识别出在某个特 定时间、 细胞以组织内的特定基因， 将此种技术应用在检测流感病毒检测诊断的临床上， 为 提高诊断准确性 提供了可靠的依据。 [0006]实时荧光定量PCR技术是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时 检测来实现了对起始模板定量以及定性的分析， 在这个扩增反应中， 将荧光化学物质引入 其中， 荧光强度的信号会随着扩增反应的进行而逐渐加强， 此时所监测到的信号就可以绘 制成一条曲线， 然后对未知模板进行定量分析。 在实际检测的过程中， 既有特异性引物存 在， 还有核苷酸探针存在， 其目的都是在进 行扩增反应时， 利用聚合酶的活性将探针进行水说　明　书 1/5 页 3 CN 114317836 A 3