(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210192293.2 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 上海市第一人民医院 地址 200080 上海市虹口区海宁路10 0号 (72)发明人 张雨翔　姚晨成　田汝辉　白昊威　 李铮　 (74)专利代理 机构 上海卓阳知识产权代理事务 所(普通合伙) 31262 代理人 周春洪 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊 断试剂盒中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种非梗阻性无精子症的检测 试剂盒， 所述试剂盒包括检测与非梗阻性无精子 症相关的遗传标记的引物对， 所述遗传标记的核 苷酸序列是ADAD2基因的序列， 所述序列的突变 位点选自c.C981G、 p.F327L、 c.1283 ‑1G>A中的一 个或多个。 本发 明还提供了检测试剂盒在诊断非 梗阻性无精子症 的应用。 以及ADAD2基因在制备 检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用。 本 发明提供了ADAD2基因的新的用途， 从而提供了 一种有效的进行非梗阻性无精子症基因诊断、 产 前基因筛查及遗传咨询的途径， 应用效果表明本 发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有 效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行ADAD2 基因突变位 点的快速 检测。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114395621 A 2022.04.26 CN 114395621 A 1.一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括检测与非梗阻 性无精子症相关的遗传标记的引物对， 所述遗传标记的核苷 酸序列是ADAD2基因的序列， 所 述序列的突变位 点选自c.C981G、 p.F327L、 c.1283 ‑1G>A中的一个或多个。 2.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述引物对， 选自primer  1、 primer   2引物对， 其中， 所述primer  1引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO:1所示， 其下游引物的 序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述primer  2引物对的上游引物的序列如SEQ  ID NO:3所示， 其 下游引物的序列如SEQ  ID NO:4所示。 3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒在诊断非梗阻性无精子症的应用。 4.ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114395621 A 2ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的 应用 技术领域 [0001]本发明属于医学基因诊 断领域， 涉及遗传病非梗阻性无精子症的致病基因ADAD2 突变位点及其在基因诊断中的应用。 背景技术 [0002]非梗阻性无精子症(NOA)通常被认为是男性不育的一个非医学可控制的原因。 这 些患者占所有不育男性的10％， 他们的无精子症的原因是精子发生异常。 以卵胞浆内单精 子注射(ICSI)为标准治疗方式的体外受精技术的建立， 使这些男性中的许多 人通过手术从 睾丸中取 出精子成功地养 育了一个孩 子。 [0003]双脱氧链终止法即Sanger测序： 反应体系中包括目标D NA片段、 脱氧三磷酸核苷酸 (dNTP)、 双脱 氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、 测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使 用的ddNTP： 由于缺少3' ‑OH基团， 不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力， 这些 ddNTP可用来中止DNA链的延伸。 此外， 这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团， 因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到 。 [0004]早期基于Sanger法的测 序设置了四个平行的测 序反应， 每一个反应中分别包括目 标片段、 DNA聚合酶、 测序引物、 四种dNTP和一种特定类型荧光(或放射性同位素)标记的 ddNTP(即不同的反应中分别为ddATP、 ddGTP、 ddCTP及ddTTP)。 通过这样的配置， 在不同的反 应中DNA链将会分别在A、 G、 C及T位中止， 并形成不同长度的DNA片断。 这些片断随后可被凝 胶电泳分开并显示出来。 变性丙烯酰胺电泳有四个泳道， 每个泳道对应一种碱基。 电泳结束 后通过放射自显影或紫外显影可读出X光片或凝胶影像。 图像中的每一个暗带表示一个双 脱氧核苷酸(ddATP， ddGTP， ddCTP， ddTTP)掺入后链终止的DNA片段的结果。 四个泳道之间的 不同暗带的相对位置可以用来读取(从底部到顶部)DNA序列， 从而得到该目标片断的碱基 排列顺序。 随着Sanger测序技术的发展， ddNTP的标记技术有了很大的提高。 不同种类的 ddNTP可以被不同荧光基团所标记， 而这些荧光基团具有相同的激发波长和不同的发射波 长， 因而在光学上表现为不同的颜色。 因此， 测序反应可以在一个体系中进行， 满足了业界 对测序速度、 自动化及通 量不断提高的要求。 [0005]Sanger操作简便， 因此被广 泛使用， 在其基础上衍生出荧光自动测 序技术等。 基于 荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用， 用于人类基因组计划 等项目。 基于毛细管电泳技术， Sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行， 商用的产 品包括Life Technologies的3130x L、 3730xL、 3500Dx与3500Dx  xL测序仪及Beck man的GeXP 遗传分析系统等。 这类系统最长可测定600 ‑1000bp的DNA片段， 且对重复序列和多聚序列的 处理较好， 序列准确性高。 [0006]中国专利文献CN  105112501  A,公开了一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒， 包 括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对， 遗传标记的核苷酸序列是DAX ‑1基 因的序列， 所述序列的突变位点选自c.152G>A、 c.312 C>G、 c.725C>T、 c.766G>C、 c.1153G>T、说　明　书 1/4 页 3 CN 114395621 A 3