(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210184581.3 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 北京吉检医疗科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区科技园区创新 路27号院1B号楼3层3 02、 303、 310室 (72)发明人 韩亚平　王玲　臧百胜　顾城玮　 郭昀欣　 (74)专利代理 机构 北京睿智保诚专利代理事务 所(普通合伙) 11732 代理人 周新楣 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/10(2006.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一管法检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒及其 应用 (57)摘要 本发明涉及试剂盒技术领域。 本发 明提供了 一管法检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒及其应 用。 该试剂盒包含两个组份。 一种是高效率的提 取试剂： 比现有的提取试剂操作更简单、 使用更 方便； 不含有机溶液， 保护操作人员和减少环境 污染。 只需要3步操作就可将血清中的乙肝病毒 DNA高效地结合至磁珠上。 另一种组分是扩增试 剂： 用于扩增的引物和探针互补结合B， C， D基因 型的共同片段， 扩增效率高达9 5%以上； 但不结合 其它病毒 （如EB病毒、 丙型肝炎病毒、 甲型肝炎病 毒等） 的核 酸序列， 特异性高。 对血清样本的最低 检测限为5国际单位/毫升 。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图8页 CN 114250326 A 2022.03.29 CN 114250326 A 1.一种乙型肝炎病毒DNA定量检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括上游引物、 下 游引物、 探针和乙型肝炎病毒DNA提取 液； 所述上游引物的序列为： a‑1： ACTGTTCAAGCCTCCAAG； b‑1： TAGGAGGCTGTAGGCATAAAT； 或c‑1： TTGTTGGTTCTTCTGGACTA； 所述下游引物的序列为： a‑2： AGAGTA ACTCCACAGAAGC； b‑2： AGATGAT TAGGCAGAGGTGAA； 或c‑2： GTGCTG GTGGTTGATGAT； 所述探针的序列为： a‑3： TGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCAT； b‑3： AGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCAT； 或c‑3： TCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述乙型肝炎病毒DNA提取液包括提取 液1~4， 所述提取液1为曲拉通X ‑100、 异硫氰酸胍盐、 盐酸胍、 Tris、 SDS、 EDTA和氯化钠中的 一种或多种。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述提取液2为4 ‑羟乙基哌嗪乙磺酸、 氯 化钠、 磁珠、 CTBA缓冲液、 1 ×TE缓冲液中的一种或多种。 4.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述提取液3为4 ‑羟乙基哌嗪乙磺酸、 曲 拉通X‑100、 Tris、 S DS和氯化钠中的一种或多种。 5.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述提取液4为矿物油、 石蜡油中的一种 或多种。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述提取液1~4的体积比为1~3： 2~4： 4~ 8： 1~3。 7.根据权利要求2~6任意一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒在提取血清时提 取液1、 血清和提取液2的体积比为3~5： 2~4： 0.5~1.5； 所述提取液3和提取液4的体积比为2~ 4： 0.5~1.5。 8.根据权利要求1~6任意一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒扩增时的程序 为： 48~52℃， 4~10min； 93~97℃， 1~3min； （92~98℃， 10~20s； 55~65℃， 30~38s） 42~48个循环； 22~28℃， 8~12s。 9.权利要求1~8任意一项所述的试剂盒在制备乙型肝炎病毒DNA检测产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114250326 A 2一管法检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及试剂盒技术领域， 尤其涉及一管法检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒及 其应用。 背景技术 [0002]目前应用于实时荧光定量PCR检测的DNA提取方法主要有四种， 即碱裂解法、 煮沸 裂解法、 层析柱法和 磁珠法。 磁珠法提取DNA是通过细胞裂解液裂解细胞， 从细胞中游离出 来的DNA分子被特异的吸附到磁性颗粒表面， 而蛋白质等杂质不被吸附， 而留在溶液中。 反 应一定时间之后， 再在磁场作用下， 使磁性颗粒与液体分开， 回收颗粒(即磁珠 ‑DNA混合 物)， 再用洗脱 液洗脱， 从而 得到纯净的DNA。 再将纯净DNA加入到P CR反应液中进 行荧光定量 PCR反应。 [0003]目前常用的磁珠法提取的过程中所用的提取剂种类繁杂， 有机溶剂的大量使用也 容易对操作者带来伤害。 且在整个洗脱过程中需要多步洗涤， 才能够相对彻底地去除蛋白 和盐分子， 进而增加了整个实时荧光定量PCR检测过程的耗时， 不仅增加了操作的工作量， 还容易出现污染， 进而影响最终的检测精度。 此外， 由于DNA提取与PCR扩增不在同一载体中 进行， 在提取物转移的过程中操作不当也会影响最终的结果， 并且洗涤次数 的增加也容易 导致的实验室污染以及DNA丢失。 [0004]因此， 如何开发一种 在一管中实现DNA的提取和扩增的试剂盒， 通过引物探针的特 异性序列来识别HBV的片段进 行扩增， 这样的好处是磁珠法提取的产 物与PCR扩增在同一载 体中进行， 不需经 过多次洗脱和洗涤导 致的DNA丢失， 对提高临床检测质量具有重要意 义。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一管法检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒及其应用， 本发明 的提取试剂， 使用磁珠法提取乙型肝炎病毒核酸(DNA)， 将整体磁珠加入到 反应液中进 行荧 光定量PCR检测， 减少因为几次洗涤而 带来的核酸丢失和间接的污染， 大大提高检测的灵敏 度， 可以达 到5IU/ml的最低检测限。 [0006]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： 本发明提供了一种乙型肝炎病毒DNA定量检测试剂盒， 所述试剂盒包括上游引物、 下游引物、 探针和乙型肝炎病毒DNA提取 液； 所述上游引物的序列为： a‑1： ACTGTTCAAGCCTCCAAG； b‑1： TAGGAGGCTGTAGGCATAAAT； 或c‑1： TTGTTGGTTCTTCTGGACTA； 所述下游引物的序列为： a‑2： AGAGTA ACTCCACAGAAGC； b‑2： AGATGAT TAGGCAGAGGTGAA；说　明　书 1/9 页 3 CN 114250326 A 3