(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210195225.1 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 江汉大学 地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技 术 开发区新江大路8号 (72)发明人 彭海　陈利红　周俊飞　李甜甜　 李论　万人静　肖华锋　方治伟　 高利芬　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 刘杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测玉米转基因品系的引物组、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本申请涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测玉米转基因品系的引物组、 试剂盒及检测方 法； 所述引物组包括29对检测引物对， 其核苷酸 序列分别如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.58所示； 引物对中引物的长度为18bp～ 30bp； 所述试剂盒 包括引物组； 所述方法包括： 分别得到玉米转基 因品系和玉米内参基因的核苷 酸序列； 根据核苷 酸序列， 分别设计出引物组； 提取待检样品的基 因组DNA， 得到待测玉米品系的基因组DNA； 以基 因组DNA为模板， 以引物组为扩增引物进行PCR扩 增， 得到扩增产物； 将 扩增产物进行高通量测序， 得到高通量测序数据； 对高通量测序数据进行分 析， 确定待测玉米样品中是否含有转基因品系； 通过设计出引物长度为18bp～30bp的29对检测 引物， 在同一PCR反应中实现多个靶标分子的同 时检测。 权利要求书1页 说明书11页 序列表10页 附图2页 CN 114507750 A 2022.05.17 CN 114507750 A 1.一种检测玉米转基因品系的引物 组， 其特征在于， 所述引物组包括29对检测引物对， 29对所述检测引物对的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.58所示； 所述引物对中各引物的长度都为18bp～3 0bp。 2.根据权利要求1所述的引物组， 其特征在于， 所述引物组还包括2对扩增引物对， 2对 所述扩增引物对包括ZmGMO30和ZmGMO31， 2对所述扩增引物对的核苷酸序列 分别如SEQ  ID  NO.59～SEQ ID NO.62所示， 用于扩增玉米内参基因zS SIIb。 3.根据权利要求1所述的引物 组， 其特征在于， 所述检测引物对用于检测17种玉米转基 因品系， 17种所述玉米转基因品系包括MON863、 NK603、 MON88017、 BT11、 MON810、 T2 5、 Bt176、 MIR604、 3272、 LY038、 MON89034、 MON8 7460、 BVLA430101、 MIR162、 DAS ‑40278‑9、 DAS‑59122、 shuangkang12 ‑5、 IE09S034、 DP‑098140‑6和Bt10。 4.一种检测玉米转基因品系的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括如权利要求1 ‑3任 一项所述的引物组。 5.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括多重PCR预混液。 6.一种准确检测玉米转基因品系的试剂 盒的应用， 其特征在于， 所述应用包括： 将如权 利要求4或权利要求5所述的试剂盒用于检测转基因玉米及玉米衍 生产品中。 7.一种检测玉米转基因品系的方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 分别得到玉米转基因品系和玉米内参基因的核苷酸序列； 根据所述玉米转基因品系和所述玉米 内参基因 的核苷酸序列， 分别设计出如权利要求 1‑3任一项所述的引物组； 提取待测样品的基因 组DNA， 得到待测玉米样品的基因 组DNA； 以所述基因 组DNA为模板， 以所述引物组为扩增引物进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通 量测序， 得到高通 量测序数据； 将所述高通 量测序数据进行分析， 确定待测玉米样品是否含有转基因品系。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述将所述扩增产物进行高通量测序， 得 到高通量测序数据， 具体包括： 将所述扩增产物进行高通 量测序文库的构建， 得到高通 量测序文库； 得到所述高通 量测序文库的实际浓度； 根据高通量测序文库的所述实际浓度和高通量测序文库说明书上标准浓度的大小， 判 断所述高通 量测序文库是否合格； 若所述实际浓度＞标准浓度， 则将所述高通 量测序文库进行测序。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述扩增体系包括： 先94℃预变性15min， 后进行第一扩增反应和 第二扩增反应， 其中， 所述第一扩增反应包括 10个降落循环， 所述降 落循环的目标温度为0.8℃。 10.根据权利 要求9所述的方法， 其特征在于， 所述第一扩增反应包括： 94℃变性20s， 65 ℃～57℃退火并延伸6 0s， 10个降落循环； 所述第二扩增反应包括： 94℃变性20s， 57℃退火并延伸6 0s。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114507750 A 2一种检测玉米转基因 品系的引物组、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本申请涉及生物技术领域， 尤其涉及一种检测玉米转基因品系的引 物组、 试剂盒 及检测方法。 背景技术 [0002]玉米是当今世界重要的粮食作物之一， 是我国三大粮食作物之首。 玉米产业健康 发展对保障国家 粮食安全和农产品有效供给具有重要意义。 玉米同时又是饲料工业和畜牧 业的重要原料之一， 其作为饲料在粮食总需求量中所占的比重逐渐增加。 从播种到收获， 玉 米多会受到多种虫害的影响， 严重影响其产量和品质。 通过基因工程途径改良作物重要性 状可以有效解决这些问题， 但是转基因玉米被直接或间接地制成食品以及国际社会对转基 因产品安全性问题的日益关注， 农产品中的转基因成分检测已纳 入国内外检验检疫部门的 检测项目并逐渐得到加强。 因此， 开发高效、 便捷的转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法； 目 前基于核酸的P CR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通定 性PCR、 巢式PCR、 环介导 等温扩增技 术(LAMP)、 荧 光定量PCR多重PCR等方法， 但是 各有缺点： [0004](1)相对于普通定性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵敏度， 容 易造成假阳性； [0005](2)LAMP操作简单、 特异性强， 然而引物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后 续的实验； [0006](3)荧光定量PC R方法具有重复性好、 灵敏度高、 核酸 交叉污染少的优点， 但其成本 高， 并且需要特殊检测仪器； [0007](4)普通的多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过六 重， 否则引物之间干扰 较大， 影响检测效果； [0008](5)基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通 量、 灵敏度高、 特异性强等优点， 且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种 转基因作物， 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 因此限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0009]因此如何基于普通的多重PCR方法在同一反应中同时检测多个靶标分子， 是目前 亟需解决的技 术问题。 发明内容 [0010]本申请提供了一种检测玉米转基因品系的引 物组、 试剂盒及检测方法， 以解决现 有技术中普通多重PCR检测方法无法在同一反应中同时检测多个 基因的技 术问题。 [0011]第一方面， 本申请提供了一种检测玉米转基因品系的引物组， 所述引物组包括29 对检测引物对， 29对所述检测引物对的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID NO.58所 示； [0012]所述引物对中各引物的长度都为18bp～3 0bp。说　明　书 1/11 页 3 CN 114507750 A 3