(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210184584.7 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 天津师范大学 地址 300387 天津市西青区 宾水西道393号 天津师范大学 (72)发明人 张亦陈　刘逸尘　孙金生　 (74)专利代理 机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 专利代理师 朱红星 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测中华绒螯蟹血蓝蛋白基因表 达的特异性探 针及应用 (57)摘要 一种用于检测中华绒螯蟹血蓝蛋白基因表 达的特异性探针及应用。 基于探针序列与目标基 因的mRNA按比例特异性结合的原理， 将荧光原位 杂交技术与图像流式细胞术结合， 通过细胞内有 无荧光信号区分不同类群， 根据信号强弱分析功 能差异， 还能拓展利用多色荧光共定位了解不同 基因是否在同一细胞中表达。 细胞分类服务于诊 断和功能研究等需求。 常规方法多采用抗体识别 来分类细胞， 但水产动物缺乏市售抗体的现状限 制了这种应用。 本方法无需抗体， 从基因序列出 发， 制备荧光标记的短探针， 杂交条件温和， 可在 完整单细胞水平开展定量分析， 在细胞分类等很 多方面具有很好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 CN 114686601 A 2022.07.01 CN 114686601 A 1.一种用于检测中华绒螯蟹血蓝蛋白基因表达的特异性探针， 其特征在于： 该探针序 列5’ ‑ GAAGATGTTATCCATGTACTTGTGGAG   ‑3’， SEQ ID NO: 1， 该探针序列分别与中华绒螯 蟹血蓝蛋白亚基编码序列GenBank:  MT989440.1的第1141 ‑1167位和中华绒螯蟹的另一个 完整血蓝蛋白亚基编码序列GenBank:  JF802122.1的第1254 ‑1280位碱基序列完全互补； 探 针采用5端FAM荧 光标记， HPLC级纯化。 2.一种配合权利要求1所述探针序列使用的方法， ， 其特征在于采用等间隔降温与分步 添加去离子甲酰胺联用的方法， 即在杂交炉控制样品从70摄氏度降温到40摄氏度的杂交过 程中， 等时间间隔地分5次， 每次向杂交体系添加终含量20%的去离子甲酰胺的独特方式， 去 离子甲酰胺能够降低杂交温度的特性。 3.采用权利要求1所述探针序列在甲壳动物血蓝 蛋白表达检测以及细胞类群分析及筛 选方面的应； 其中所述的甲壳动物指凡纳滨对虾、 克氏原螯虾， 在 靶基因的检测区间具有与 权利要求1所述探针特异性结合能力的多种甲壳动物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114686601 A 2一种用于 检测中华绒螯蟹血 蓝蛋白基因表达的特异性探针及 应用 [0001]本专利申请由天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室完成， 得到天津市应用基础与前沿技术研 究计划 （19JCYB JC29700） ， 天津市水产生态及养殖重点 实验室开 放基金(TJAE2015 005)。 技术领域 [0002]本发明属于检测技术领域， 涉及一种以探针序列与目标基 因靶序列按比例特异性 结合为基础， 将荧光原 位杂交技术与流式细胞检测技术相结合的单细胞水平高通量的基因 表达测量及细胞分类的新型自动化检测方法。 本方法分类中华绒螯蟹血细胞不用借助抗 体， 只需获得目的基因部 分序列信息， 即可合 成探针序列， 较短的探针可以提高扩散和杂交 效率， 显著缩短杂交时间； 通过较为温和的独特杂交操作后， 根据探针信号有 无及强弱分析 特定细胞类 群及功能。 本发明为甲壳动物免疫学研究提供了新的技 术方案。 背景技术 [0003]细胞的分类和分离是功能研究的前提和基础， 血细胞是免疫系统的核心， 因此血 细胞的分类辨识 等相关技术是各种动物免疫 学研究的基础支撑。 目前常用的抗体分类等医 学血液学方法 并不适用与虾、 蟹等甲壳动物， 主要原因是缺乏市售的分类专用抗体。 另一方 面， 血细胞分类的目的是为了研究其功能， 而功能本身依靠的是关键分子。 就甲壳动物而 言， 血蓝蛋白是血淋巴中的主要蛋白质组分， 目前研究发现其由肝胰腺细胞和血细胞等部 位合成后分泌到胞外行使功能。 也有一些研究发现血蓝蛋白在伴随动物进化过程中还具备 了类似酚氧化酶的活性， 因此血蓝蛋白作为一种重要的功能分子， 是目前的研究热点， 新的 更精准的测量方法也有助于解析其作用原理和参与免疫应答的调控机制。 [0004]血蓝蛋白是广泛分布于节肢动物及软体动 物血淋巴中的一种含铜的呼吸蛋白， 其 脱氧时为无色， 结合氧后转为蓝 色。 其生物学功能主要与机体内的氧输送有关， 但近几年的 研究也逐渐证实血蓝蛋白是一种多功能蛋白， 除了输氧功能外， 还参与渗透压的维持、 能量 的储存以及蜕皮调控等额外功能， 甚至具有与酚氧化酶类似的活性和抗菌效力， 所以血蓝 蛋白被认为是节肢动物与软体动物的一种重要免疫分子。 生物信息学分析提示血蓝蛋白可 能是由酚氧化 酶进化而来的， 因此二者在物理、 化学性质等方面 非常相似。 Decker 等发现狼 蛛体内的血蓝蛋白分子可通过胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶水解转化为单酚氧化物酶以及O ‑ 双酚氧化物酶， 从而表现出酚氧化 酶活性。 Salvato等证明pH  6的微酸性环 境可诱导软体动 物来源的血蓝蛋白表现出O ‑双酚氧化物酶的活性， 未经水解的血蓝蛋白也可表现出酚氧化 物酶活性。 血蓝蛋白除了具有酚氧化物酶活性外， 还可在特定条件下断裂为具有抗真菌和 细菌功能的肽段， 抵抗病原微 生物入侵 。 [0005]流式细胞仪是一种将多领域先进技术相结合的重要检测设备， 利用现代免疫荧光 技术、 流体力学、 激光学、 应用电子学以及计算机等技术和原理， 它可以对细胞长宽、 大小、 表面抗原识别标记等进行快速、 定量、 多参数的检测， 也能通过胞内的核酸定量检测分析说　明　书 1/8 页 3 CN 114686601 A 3