(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210187701.5 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 中国食品药品检 定研究院 地址 100050 北京市东城区天坛西里2号 (72)发明人 张文娟　魏锋　马双成　程显隆　 石岩　于健东　陆以云　 (74)专利代理 机构 北京攀腾 专利代理事务所 (普通合伙) 11374 专利代理师 彭蓉　游舜华 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种探针引物及其用于平贝母专属性检测 的荧光定量PCR检测方法和用途 (57)摘要 本发明提供了一种探针引物及其用 于平贝 母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。 所述探针引物是由SEQ  ID NO： 28‑39所示的DNA 序列组成。 所述检测方法可有效检出平贝母， 专 属性强， 灵敏度高， 可用于 药材、 饮片或成方制剂 中是否存在 平贝母的定性 或定量检测， 具有重要 的实用价 值和应用前 景。 权利要求书1页 说明书12页 附图2页 CN 114540346 A 2022.05.27 CN 114540346 A 1.一种探针引物， 其特征在于， 所述探针引物是由SEQ  ID NO： 28‑39所示的DNA序列组 成。 2.一种用于平贝母专属性检测的荧 光定量PCR检测方法， 其特 征在于， 包括下述 步骤： 称取贝母样品及样品前处 理； 从所述样品中提取DNA并制备DNA模板； 及 选择探针引物； 优化反应条件； 根据不同的检测需求， 设定不同的判定依据； 其中对于定性检测， 根据设定的CT值临界点 判定是否检出； 对于半定量检 测， 根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作为判定依据， 差值越 小， 含量越高； 对于定量检测， 一方面同时设置标准品(S)， 另一方面采用同体系中双探针标记 进行扩增， 即包括目的探针(P)和内参探针(C)； 供试品中专属探针(P)和通用探针(C)的定量 检测比值可表示为 △CT(T)， 相应的标准品可表示为 △CT(S)，△△CT＝△CT(T)‑△CT(S)从而 目的DNA(平贝母)所占比例计算公式可表示为： 其中， 所述方法能够用于检测所述样品中是否含有平贝母； 所述探针引物为权利要求1 所述的探针引物。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中每组探针引物包括三个序列， 并且当任何一组用于 检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。 4.根据权利要求2所述的方法， 其中所述样品为中药 材、 饮片或 成方制剂。 5.根据权利要求2所述的方法， 其中所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量 和纯度测定 。 6.根据权利要求2所述的方法， 其中所述反应条件包括： 94℃预变性5min， 94℃变性 30s， 60℃退火30～60s， 60℃收集荧光。 根据所选反应预混液性质的不同， 反应条件可进行 调整。 7.一种探针引物 的用途， 其特征在于， 所述探针引物为权利要求1所述的探针引物； 所 述探针引物通过荧 光定量PCR检测方法实现平贝母专属性检测。 8.根据权利要求7所述的用途， 其中每组探针引物包括三个序列， 并且当任何一组用于 检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。 9.根据权利要求7 所述的用途， 其中检测的样品为中药 材、 饮片或 成方制剂。 10.一种试剂 盒， 其特征在于， 含有权利要求1所述的探针引物， 并且所述试剂 盒用于平 贝母专属性检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540346 A 2一种探针引物及其用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检 测方法和用途 技术领域 [0001]本发明属于医药技术领域， 涉及药物鉴别检测方法， 尤其涉及一种探针引 物及其 用于平贝母专属性检测的荧 光定量PCR检测方法和用途。 背景技术 [0002]贝母类药材是常用大宗药材， 具有止咳化痰功效， 其中川贝母、 伊犁贝母和平贝母 均收录于 《中华人民共和国药典》 (简称 《中国药典》 )， 传统认为川贝母效果最佳， 且以野生 为主， 价格在各种贝母药材中居 首位； 而伊犁贝母和平贝母为种植品， 产量较大， 价格较低。 《中国药典》 川贝母的基原来源收录了百合科植物的6个物种， 即川贝母Fritillaria   cirrhosa D.Don、 暗紫贝母F.u nibracteata  Hsiao et K.C.Hsia、 甘肃贝母F.p rzewalskii  Maxim.、 梭砂贝母F.delavayi  Franch.、 太白贝母F.taipaiensis  P.Y.Li或瓦布贝母 F.unibracteata  Hsiao et K.C.Hsia  var.wabuensis(S.Y.Tang  et S.C.Yue)Z.D.Liu, S.Wang et S.C.Chen， 按性状差异又 可分为松贝、 青贝、 炉贝及栽培品。 [0003]川贝母市场需求量较大， 但野生资源有限， 伪品屡见不鲜。 常见伪品来源主要有伊 犁贝母和平贝母等。 川贝母掺伪 现象严重扰乱了公平竞争的市场秩序， 影响着用药 的安全 性和有效性， 最终侵害了消费者的经济和健康利益。 发明内容 [0004]本发明提供了一种探针引物及其用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法 和用途。 所述检测方法可有效检出平贝母， 专属性 强， 灵敏度高， 可用于药材、 饮片或成方制 剂中是否存在平贝母的定性或定量检测， 具有重要的实用价 值和应用前 景。 [0005]一方面， 本发明提供了一种探针引物。 所述探针引物其由SEQ  ID NO： 28‑39所示的 DNA序列组成。 [0006]另一方面， 本发明提供了一种用于平贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法。 所 述方法包括下述 步骤： [0007]称取贝母样品及样品前处 理； [0008]从所述样品中提取DNA并制备DNA模板； 及 [0009]选择探针引物； [0010]优化反应条件； [0011]根据不同的检测需求， 设定不同的判定依据； 其中对于定性检测， 根据设定的CT值 临界点(如CT<35)判定是否检出； 对于半定量检测， 根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作 为判定依据， 差值越小， 含量越高； 对于定量检测， 一方面同时设置标准品(S)， 另一方面采 用同体系中双探针标记进行扩增， 即包括目的探针(P)和内参探针(C)； 供试品中目的探针 (P)和内参探针(C)的定量检测比值可表示为 △CT(T)， 相应的标准品可表示为 △CT(S)，△ △CT＝△CT(T)‑△CT(S)从而目的DNA(伊犁贝母或者平贝母)所占比例计算公 式可表示为：说　明　书 1/12 页 3 CN 114540346 A 3