(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210187640.2 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 贵州安康医学检验中心有限公司 地址 550000 贵州省贵阳市贵阳国家高新 技术产业开发区黔灵山路357号德福 中心A3栋1单元2层9号、 10号 (72)发明人 王宇　余红岚　赵雪　郝家明　 (74)专利代理 机构 重庆强大凯创专利代理事务 所(普通合伙) 50217 专利代理师 刘永来 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传 感器 (57)摘要 本发明涉及生物医药检测技术领域， 具体涉 及一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感 器的人类肠道病毒EVA71的检测系统， 包括用于 扩增EVA71的PV1基因的多交叉恒温扩增单元和 检测单元； 所述多交叉恒温扩增单元包括引物组 合、 链置换DNA聚合酶、 Bst  DNA聚合酶缓冲液和 MgSO4等。 检测单元为金纳米生物传感器， 本方案 采用多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感器的 方法。 本方案不但有费用低廉和操作时间短的特 点， 而且它的检测灵敏度更高， 无需昂贵的PCR产 物检测仪器。 本方案解决了现有的EVA71检测方 法成本高、 耗时长、 操作复杂和检测灵敏度低等 技术问题， 将其应用在POCT等医学检测领域， 具 有广阔的应用前 景。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图2页 CN 114540548 A 2022.05.27 CN 114540548 A 1.一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒EVA71的检测系统， 其特征在于： 包括用于扩增EVA71的PV1基因的多交叉恒温扩增单元； 所述多交叉恒温扩增 单元包括引物组合； 所述引物组合包括置换引物、 交叉内引物和扩增引物； 所述置换引物包 括序列如SEQ  ID NO:1所示的F 1和序列如SEQ  ID NO:2所示的F2； 所述交叉内引物包括序列 如SEQ ID NO:3所示的CP 1和序列如SEQ  ID NO:4所示的CP2； 所述扩增引物包括序列如SEQ   ID NO:5所示的C1和序列如SEQ  ID NO:6所示的C2、 序列如SEQ  ID NO:7所示的D 1和序列如 SEQ ID NO:8所示的D2以及序列如SEQ  ID NO:9所示的R 1和序列如SEQ  ID NO:10所示的R2。 2.根据权利要求1所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特征在于： 还包括检测单元； 所述检测单元为金纳米生物传感器或 者可视化检测单 元； 所述可视化检测单 元包括核酸扩增指示剂。 3.根据权利要求2所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特 征在于： 所述扩增引物中的至少两条 标记有标记分子 。 4.根据权利要求3所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特征在于： C1 的5’端标记有第一标记分子， 形成C1*； D1 的5’端标记 有第二标记分子， 形成D1* 。 5.根据权利要求4所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特 征在于： 所述第一标记分子为 生物素； 第二标记分子为 荧光素。 6.根据权利要求5所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特征在于： 所述多交叉恒温扩增单元还包括链置换DNA聚合 酶、 N,N, N‑三甲基甘 氨酸、 dNTP、 Bst  DNA聚合酶 缓冲液和MgSO4。 7.根据权利要求6所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特征在于： CP1、 CP2、 F1、 F2、 R1、 R2、 D1*、 D2、 C1*和C2的工作浓度分别 为： 60pmol、 60pmol、 10pmol、 10pmol、 30pmol、 30pmol、 30pmol、 30pmol、 20pmol和20pmo l。 8.根据权利要求6所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特征在于： 所述多交叉恒温扩增单元的工作温度为61 ‑68℃， 反应时 间为40min。 9.根据权利要求8所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 其特征在于： 所述金纳米生物传感器依次设置的样品垫、 金标垫、 硝酸 纤维素膜和吸水垫； 金标垫上包被有高分子纳米粒子偶联 的链霉素亲和素； 硝酸纤维素膜 上设置有检测线及控制线； 检测线上固定有荧光素抗体， 质控线上固定有生物素偶联的牛 血清蛋白。 10.根据权利要求9所述的一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道 病毒EVA71的检测系统， 其特 征在于： 所述检测系统的检测下限为 4copies/uL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540548 A 2一种基于多交叉恒 温扩增和金纳米生物传感器 技术领域 [0001]本发明涉及 生物医药检测技术领域， 具体涉及一种基于多交叉恒温扩增和金纳 米 生物传感器的人类肠道病毒EV A71的检测系统。 背景技术 [0002]目前对于肠道病毒EVA71的检测的金标准主要依赖于传统的病毒培养和中和试 验。 该方法耗时大约5到7天， 包括细胞培养， 接种及后续的中和试验， 其劣势是耗时耗力。 随 着核酸诊断技术的快速发展， 以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术， 荧光PCR技术)被用 于EVA71的检测， 然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备以及探针合成， 需要后续的电泳操 作， 且对操作人员的熟 练程度有较高的要求。 以P CR为基础的诊断技术对于一些落后的实验 室无法进行， 限制了这些技术的运用。 并且目前运用这些检测技术诊断肠道病毒EVA71的 PCR方法和Real ‑time PCR方法， 检测过程 耗时较长， 不利于快速检测 和应急检测。 [0003]为了克服PCR扩增技术的劣势， 近年来发展了许多恒温扩增技术。 恒温扩增技术较 PCR技术而言， 不依赖于热循环扩增设备， 反应速度快， 敏感性好。 因此， 恒温扩增技术有利 于实现快速扩增， 便捷检测及现场诊断。 到目前为止， 已发展的恒温扩增技术有10余种， 应 用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、 连置换扩增(SDA)、 解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、 环介导 恒温扩增(LAMP)、 交叉扩增(CPA)等。 然而， 这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工 作， 依赖于昂贵的试剂和复杂的操作步骤。 因此这些方法的实用性， 便捷性， 可操作性有待 于提高， 尤其是在快速诊断领域及欠 发达地区， 上述恒温扩增技术难以实施。 亟需研发一种 适合于人类肠道病毒EVA71检测的基于恒温扩增系统的、 可有效降低成本和提升检测便捷 程度的快速检测技 术。 发明内容 [0004]本发明的目的在于一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病 毒EVA71的检测系统， 用以解决现有的检测方法成本高、 耗时长、 操作复杂和 检测灵敏度低 等技术问题。 [0005]为解决上述 技术问题， 本发明技 术方案如下： [0006]一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒EVA71的检测系 统， 包括用于扩增 EVA71的PV1基因的多交叉恒温扩增单元； 所述多交叉恒温扩增单元包括 引物组合； 所述引物组合包括置换引物、 交叉内引物和扩增引物； 所述置换引物包括序列如 SEQ ID NO:1所示的F 1和序列如SEQ  ID NO:2所示的F2； 所述交叉内引物包括序列如SEQ  ID  NO:3所示的CP1和序列如SEQ  ID NO:4所示的CP2； 所述扩增引物包括序列如SEQ  ID NO:5所 示的C1和序列如SEQ  ID NO:6所示的C2、 序列如SEQ  ID NO:7所示的D1和序列如SEQ  ID NO: 8所示的D2以及序列如SEQ  ID NO:9所示的R 1和序列如SEQ  ID NO:10所示的R2。 [0007]采用上述 技术方案， 技 术原理为： [0008]本技术方案使用多交叉恒温扩增单元对待测样本中的EVA 71的PV1基因进行扩增，说　明　书 1/10 页 3 CN 114540548 A 3