(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221019143 3.4 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 宁夏回族自治区疾病预防控制中心 （宁夏回族自治区性病艾滋病防治 中心） 地址 750003 宁夏回族自治区银川市 兴庆 区胜利南 街470号 (72)发明人 马江涛　蒯文和　张银豪　赵建华　 马学平　高建炜　刘翔　袁芳　 曹慜　魏开心　石安琪　 (74)专利代理 机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 专利代理师 崔瑞迎 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种新冠病毒核酸检测阳性质控品及其制 备方法和用途 (57)摘要 本发明属于病毒检测技术领域， 涉及一种新 冠病毒核酸检测阳性质 控品及其制备方法和用 途， 所述阳性质控品由假病毒培养物， 与扩增标 签基因的引物、 探针和RT ‑PCR反应液共同组成， 所述假病毒培养物由ORF1ab基因、 N基因、 E基因 和标签基因构建重组质粒， 转座， DNA的分离提 取， 转染， 分离获得。 本发明通过检测标签基因， 能够及时准确区分阳性质控品和新型冠状病毒， 从而准确判断是实验室污染， 还是新冠病毒感 染。 权利要求书2页 说明书6页 序列表4页 附图3页 CN 114561492 A 2022.05.31 CN 114561492 A 1.一种新冠病 毒核酸检测阳性质控 品， 其特征在于， 所述阳性质控 品由假病 毒培养物， 与扩增标签 基因的引物、 探针和RT ‑PCR反应液共同组成； 所述假病毒培养物由ORF1ab基因、 N基因、 E基因和标签基因构建重组质粒， 转座， DNA的 分离提取， 转染， 分离获得； 所述标签 基因的核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示； 检测所述标签 基因的上游引物如SEQ  ID No.5所示， 下游引物如SEQ  ID No.6所示； 检测所述标签 基因的探针的序列如SEQ  ID No.7所示。 2.一种权利要求1所述的新冠病 毒核酸检测阳性质控 品的制备方法， 其特征在于， 具体 包括如下步骤： S1， 目的基因的获得： 分别扩增获得ORF1ab基因， N基因， E基因， 合成标签 基因； 所述ORF1ab基因的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述N基因的核苷酸序列如SEQ  ID  No.2所示， 所述E基因的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示； S2， 构建重组质粒： 将ORF1ab基因、 N基因、 E基因和标签基因酶切并连接至pFastBac载体构建重组质粒 pFastBac ‑X， 转化至感受态细胞， 挑选阳性单 克隆进行扩大培 养并提取质粒； S3， 重组质粒pFastBac ‑X的转座： 将重组质粒pFastBac ‑X转化至DH10BacTM感受态细胞， 蓝白斑筛 选， 挑选白色克隆； S4， 重组Bacmid ‑X DNA的分离提取： 挑选的白色克隆菌， 培 养后提取DNA获得重组Bacmid ‑X DNA； S5， 重组Bacmid ‑X转染sf9细胞； S6， 病毒原种的分离与贮存： 当细胞出现感染迹象时， 离心获得含病毒的上清液， 即为假病毒培养物， 与检测所述标 签基因的引物、 探针和RT ‑PCR反应液共同组成新冠病毒 核酸检测阳性质控品。 3.根据权利要求2所述的新冠病 毒核酸检测阳性质控 品的制备方法， 其特征在于， 所述 标签基因选自植物。 4.根据权利要求3所述的新冠病 毒核酸检测阳性质控 品的制备方法， 其特征在于， 所述 植物为野生大豆 。 5.根据权利要求2所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法， 其特征在于， S2 中， 所述感受态细胞为DH 5α 。 6.根据权利要求2所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法， 其特征在于， S5 中， 重组Bacmid ‑X转染sf9细胞的具体过程如下： (1)在培养板中接种9 ×105个sf9细胞， 27℃培 养1h， 使细胞贴壁； (2)制备Bacmid ‑X与Cellfectin Reagent复合物； (3)在制备Bacmid ‑x与Cellfectin  Reagent复合物期间， 将培养板中 的培养基吸掉， 用 不完全Grace ’s medi μm洗涤， 去掉培 养基； (4)在含有210 μl的复合物的管 内加入800 μl的不完全Grace ’s medi μm， 混匀， 加到培养 板的每个孔中； (5)将培养板内的细胞27℃孵 育5h；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114561492 A 2(6)去掉复合物混合液， 然后在每 个孔中加2ml完全培 养基； (7)培养至细胞出现病毒感染迹象。 7.根据权利要求6所述的新冠病 毒核酸检测阳性质控 品的制备方法， 其特征在于， 培养 至细胞出现病毒感染迹象即在27℃， 培 育72h。 8.根据权利要求2所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品的制备方法， 其特征在于， S6 中， 离心条件为5 00g离心5mi n。 9.一种权利要求1所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品在制备新冠病 毒检测试剂盒中 的用途。 10.根据权利要求9所述的新冠病毒核酸检测阳性质控品在制备新冠病毒检测试剂盒 中的用途， 其特征在于， 检测过程中的判定标准为： 若检出新冠病毒核酸阳性标本， 可增加 标签基因检测步骤， 如果检测标签基因时扩增出曲线， 则为阳性质控品污染， 若没有扩增出 曲线， 则为 新冠病毒感染。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114561492 A 3