(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210193221.X (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 上海中医药大学附属龙华医院 地址 200032 上海市徐汇区宛平南路725号 (72)发明人 刘维薇　王卫峰　吴丽霞　李可　 李媛　范强缘　 (74)专利代理 机构 上海中优律师事务所 31284 专利代理师 潘诗孟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种 高危型HPV的方法 (57)摘要 本发明公开了一种通过高通量二维PCR单管 闭管检测多种高危型HPV的方法， 主要包括建立 二维PCR的探针及标签库、 设计高通量二维PCR反 应体系并进 一步优化和二维PCR技术应用及性能 评估三大步骤。 本发明建立了高通量二维PCR单 管闭管检测13种高危型HPV 的检测方法， 通过对 方法的灵敏度、 特异性等一系列指标分析评估应 用于临床 筛查的潜力， 为临床的快速筛查诊治提 供依据。 权利要求书4页 说明书10页 附图4页 CN 114457196 A 2022.05.10 CN 114457196 A 1.一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法， 其特征是， 包括以下 步骤： S1： 建立二维PCR的探针及标签库； S2： 设计高通 量二维PCR反应 体系并进一 步优化； S3： 二维PCR技 术应用及性能评估。 2.根据权利要求1所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法， 其 特征是， 所述步骤S1包括： S11： 针对常用的FAM、 VIC、 Cy5三个荧光检测通道， 设计三个探针序列， 并在5'端添加相 应的荧光基团， 3'端由磷酸基团封闭， 如表1所示： 表1 S12： 针对标签的反向互补序列即前标签设计多组与前标签同源的序列， 以FAM荧光通 道为例， 前 标签如表 2所示： 表2 S13： 将每组前标签序列与其对应的碱基猝灭探针进行熔解温度的探索， 以FAM荧光通 道为例， 猝灭探针基团序列如表3所示； 每管25 μL  PCR反应体系组成如下： 2.5 μL的10x无镁 离子缓冲液， 1.5 μL的2 5mM镁离子 溶液， 0.5 μL的4 ×10mM dNTPs， 0.25 μL的5U/ μL  Taq DNA聚 合酶， 0.1μL  10 μM的前标签， 0.1μL的10 μM的探针， 加入去离子水补足反应体系至25 μL； PCR 反应程序如下： 95℃10秒， 30℃4分钟， 而后荧光信号收集时温度持续上升至80℃； 并依据获 得的熔解温度和熔解曲线的优劣对前 标签序列进行筛 选,建立合适的探针及标签库。 表3权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114457196 A 23.根据权利要求1所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法， 其 特征是， 所述步骤S2包括： S21： 选择16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 5 1、 56、 52、 58、 59、 68型在内的共计 13种高危型HPV基 因亚型； 人血红蛋白β 亚基和血红蛋白δ亚基基因作为内参基因， 用同一对引物扩增这两个 基因， 以下称HB B&HBD基因， 并视为 一个待检 基因； S22： 设计三荧光通道检测模式： FAM荧光检测通道检测HPV16、 18、 31、 33、 58型及HBB& HBD基因； VIC荧光检测通道 检测HPV35、 39、 45、 51、 52型； Cy5荧光检测通道中检测HPV 56、 59、 68型； S23： 制备FAM荧光检测通道、 VIC荧光检测通道及Cy5荧光检测通道的引物及探针， 以 FAM荧光检测通道为例， 如表4所示； 引物及探针均按照要求用缓冲液稀释为10 μM； 表4 S24： 制备包含不同HPV扩增子的质粒样本， 质粒样本原液进行稀释， 稀释完成后， 每个 HPV亚型质粒样 本选用七个稀释的样 本， 浓度在10^1拷贝/ μL到10^7拷贝/ μL进行后续实验，权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 114457196 A 3