(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210192180.2 (22)申请日 2022.03.01 (71)申请人 武汉科技大 学 地址 430000 湖北省武汉市和平大道 947号 (72)发明人 廖兴华　沈超　李佳蓬　项园　 戴周彤　张慧敏　王君　黄优　 宗启贝　李乐威　 (74)专利代理 机构 武汉红观 专利代理事务所 (普通合伙) 42247 专利代理师 黄鑫 (51)Int.Cl. C12Q 1/6841(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/569(2006.01)G01N 33/574(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/58(2006.01) (54)发明名称 miR-589-3p水平原位杂交检测试剂盒及检 测方法 (57)摘要 本发明提出了miR ‑589‑3p水平原位杂交检 测试剂盒及检测方法， 其中试剂盒包括CD30单 抗、 miR‑589‑3p探针、 封闭液、 固定液、 杂交液和 复染剂。 本发明采用CD30免疫 荧光抗体联合 miR‑ 589‑3p荧光原位杂交探针检测癌症病变情况， 克 服了荧光原位杂交检测存在假阳性、 穿透力差的 技术问题。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114645076 A 2022.06.21 CN 114645076 A 1.miR‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒， 其特征在于： 包括CD30单抗、 miR ‑589‑3p探 针、 杂交液、 固定液、 封闭液和复染剂。 2.如权利要求1所述的miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒， 其特征在于： 所述CD30单 抗为荧光标记的CD30单抗， 所述miR ‑589‑3p探针为miR ‑589‑3p荧光原位杂交探针， 其核苷 酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 3.如权利 要求1所述的miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒， 其特征在于： 所述杂交液 包括质量分数为15％ ‑30％的硫酸葡聚糖、 浓度为2 ‑5mol/L的甲酰胺、 浓度为1 ‑2mol/L生物 异硫氰酸胍， 6 ×SSC和体积分数为1 ‑3％的Trito n‑100， 溶剂为去离 子水。 4.如权利 要求1所述的miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒， 其特征在于： 所述 固定液 包括甲醇和冰乙酸， 所述甲醇和冰乙酸的体积比为(2 ‑5):1。 5.如权利 要求1所述的miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒， 其特征在于： 所述封闭液 包括质量分数为1 ‑3％的BSA、 质量分数为3 ‑5％的Twe en20和10 ×SSC， 溶剂为去离 子水。 6.如权利 要求1所述的miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒， 其特征在于： 所述复染剂 为PI/antifade或DAPI/antifade染液。 7.如权利要求1 ‑6任一所述的miR ‑589‑3p水平原位杂 交检测试剂盒的使用方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： S1， 制片： 收获细胞样本转入离心管， 离心后弃上清， 然后经过低渗、 预固定和固定操 作， 制成细胞 悬液， 吸取细胞 悬液滴至载玻片上， 经老化后得到细胞制片； S2， 杂交前处 理： 细胞制片经封闭， 穿 孔和脱水后得到 干燥玻片； S3， 变性处理： miR ‑589‑3p荧光原位杂交探针和细胞玻片均在70 ‑80℃条件下变性处 理； S4， 杂交孵育： 将荧光标记的CD30单抗、 已变性的miR ‑589‑3p荧光原位杂交探针和杂交 液混匀， 然后滴至变性后的细胞玻片杂交区域， 然后盖上盖玻片， 封边后进行杂交孵 育； S5， 洗涤： 孵 育结束后， 细胞玻片经多次洗脱， 去离 子水浸泡后自然干燥； S6， 封片观察： 将复染剂滴加至 干燥后的细胞玻片上， 在荧 光显微镜下观察玻片。 8.如权利 要求7所述的miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒的使用方法， 其特征在于： 步骤S3所述变性处理为： 将细胞玻片浸入 70‑80℃的体积分数为70％的甲酰胺/2 ×SSC的变 性液中变性2 ‑3min； 将miR ‑589‑3p荧光原位杂交探针在70 ‑80℃恒温水浴中温育5min， 然后 置于0℃5～10mi n， 使双链DNA探针 变性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114645076 A 2miR‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及医药技术领域， 尤其涉及miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试剂盒及 检测 方法。 背景技术 [0002]荧光原位杂交(Fluorescence  in situ hybridization， FISH)是一门新兴的分子 细胞遗传学技术， 是20世纪8 0年代末期在原有的放射性原 位杂交技术的基础上发展起来的 一种非放射性原位杂交技术。 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色 体精细结构 变异分析、 病毒感染分析、 人类产前诊断、 肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多 领域。 [0003]FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针， 按照碱基互补的原则， 与待检 材料中未知的单链核酸进 行异性结合， 形成可被检测的杂交双链核酸。 由于DNA分子在染色 体上是沿着染色体纵轴呈线性排列， 因而 可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基 因在染色体上定位。 与传统的放射性标记原位杂交相比， 荧光原 位杂交具有快速、 检测信号 强、 杂交特异性高和可以多重染色等特点， 因此在分子细胞遗传学 领域受到普遍关注。 [0004]Micro RNA(miRNA)是一类内生的、 长度约为18 ‑25个核苷酸的非编码小分子RNA， 常通过结合靶标信使RNA(m  RNAs)的3 ’非翻译区(3 ’UTR)抑制其翻译或加速其降解这两种 主要机制调控mRNA的表达， 从而在生物体发育， 疾病的发生 发展等方面 发挥重要作用， 其在 肿瘤中的作用也越来越被人们所重视。 miR ‑589有关研究主要是针对miR ‑589‑5P的研究， 而 且miR‑589‑5P的研究采用Nort hern杂交、 表达芯片、 实时荧光定量PCR和Solexa测序等高通 量基因芯片分析技术， 比如： miR ‑589‑5P的表达量在肝癌组织中呈负相关， miR ‑589‑5P可用 于诊断急性痛风。 并无miR ‑589‑3P水平原位杂交在癌症病变前期检测中的应用的研 究。 同 时目前广泛使用的miRNA 荧光原位杂交存在自身荧光穿透力差， 造成假阳性的技术问题， 降 低了检测灵敏度。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提出了可以降低假阳性， 提高检测灵敏度的miR ‑589‑3p水平原 位杂交检测试剂盒及检测方法。 [0006]本发明的技术方案是这样实现的： 本 发明提供了miR ‑589‑3p水平原位杂交检测试 剂盒， 其特 征在于： 包括CD3 0单抗、 miR ‑589‑3p探针、 杂交液、 固定液、 封闭液和复染剂。 [0007]在以上技术方案的基础上， 优选的， 所述CD30单抗为荧光标记的CD30单抗， 所述 miR‑589‑3p探针为miR ‑589‑3p荧光原位杂交探针， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 [0008]在以上技术方案的基础上， 优选的， 所述杂交液包括质量分数为15％ ‑30％的硫酸 葡聚糖、 浓度为2 ‑5mol/L的甲酰胺、 浓度为1 ‑2mol/L生物异硫氰酸胍， 6 ×SSC和体积分数为 1‑3％的Trito n‑100， 溶剂为去离 子水。 [0009]在以上技术方案的基础上， 优选的， 所述固定液包括甲醇和冰乙酸， 所述甲醇和冰说　明　书 1/5 页 3 CN 114645076 A 3