(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210192367.2 (22)申请日 2022.03.01 (71)申请人 云南省农业科 学院生物技 术与种质 资源研究所 地址 650205 云南省昆明市北京路2 238号 云南省农业科 学院 (72)发明人 陈玲　张敦宇　程在全　殷富有　 钟巧芳　王波　卢源达　肖素勤　 张云　王玲仙　柯学　余腾琼　 蒋聪　刘丽　 (74)专利代理 机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 专利代理师 崔玥 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01)C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种高效分离带有野生稻血缘的抗白叶枯 病基因及其家族成员的方法 (57)摘要 本发明提供了一种高效分离带有野生稻血 缘的抗白叶枯病基因及其家族成员的方法， 属于 分子生物学技术领域。 本发明提供了一种高效分 离带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因及其家族 成员的方法， 利用来自元江普通野生稻与栽培稻 杂交获得的多样化抗谱后代材料， 高效快速地克 隆到Xa47(t)基因及其家族成员， 不仅为分离新 的基因提供了较好的借鉴方法， 同时避免了常规 图位克隆的繁琐和耗时费力， 利用元江普通野生 稻杂交后代(渗入系)获得的家族成员， 其遗传背 景清晰， 为后续研究家族成员的功能以及育种利 用奠定了坚实的基础。 权利要求书2页 说明书15页 序列表32页 附图5页 CN 114438100 A 2022.05.06 CN 114438100 A 1.一种高效分离带有野生稻血缘的抗 白叶枯病基因的方法， 其特征在于， 所述方法包 括： 通过对元江普通野生稻渗入系双亲进行建库和高通量测序获得连续基因组， 将所述连 续基因组与参考基因组进行共线性分析， 根据目的基因定位情况， 筛选出所述抗白叶枯病 基因的候选基因， 根据所述候选基因设计引物进行PCR扩增、 PCR产物直接测序和抗病功能 分析， 从而分离出 带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因。 2.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述抗白叶枯病基因为Xa47(t)， 所述基因 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示； 所述基因Xa47(t)的CD S序列如SEQ  ID NO.14所示。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述元江普通野生稻渗入系双亲为元江普 通野生稻和栽培稻合系35； 所述参考基因组为日本晴基因组； 所述目的基因定位和所述P CR 扩增的模板为元 江普通野生稻渗入系G252。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述引物为214QC ‑9F/R； 所述214QC ‑9F的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.11所示， 所述214 QC‑9R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述抗病功能分析包括功能互补试验和基 因编辑试验分析候选基因的抗病功能。 6.一种高效分离带有野生稻血缘的抗 白叶枯病基因家族成员的方法， 其特征在于， 所 述方法包括： 筛选获得含有Xa47(t)基因或其同源基因的元江普通野生稻渗入系材料； 根据权利要 求2所述Xa47(t)基因序列， 获得来自元江普通野生稻和合系35中的Xa47(t)基因， 分别命名 为Xa47(t)YP和Xa47(t)HX； 利用引物对所述元江普通野生稻渗入系不同材料进行扩增、 测序， 得到4种Xa47(t)基 因的基因型： Xa47(t)G252、 Xa47(t)YP、 Xa47(t)HX以及Xa47(t)L234； 对由4种基因型编码得到的 蛋白质进行相似性分析， 从而确定其是否为带有野生稻血缘的抗白叶枯病基因家族成员。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述筛 选的步骤 包括： 利用Xa47(t)基因的共分离标记Hxj y‑1对元江普通野生稻渗入系进行PCR扩增， 得到扩 增片段大小为167bp的渗入系， 结合渗入系的抗病谱筛选出含有Xa47(t)基因或其同源基因 的元江普通野生稻渗入系材 料。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 根据权利要求2所述的Xa47(t)基因序列， 利用blast程序从元江普通野生稻和合系35基因组R13I14和Hxjy ‑14区段中进行检索， 即获 得来自元 江普通野生稻和合系3 5中的Xa47(t)基因。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述引物包括214QC ‑2F/R、 48QC ‑9F/R和 48QC‑11F/R， 所述214QC ‑2F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.17所示， 所述214QC ‑2R的核苷酸序 列如SEQ ID NO.18所示； 所述48QC ‑9F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.19所示， 所述48QC ‑9R的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.20所示； 所述48QC ‑11F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.21所示， 所述 48QC‑11R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.22所示。 10.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述Xa47(t)G252、 Xa47(t)YP、 Xa47(t)HX以 及Xa47(t)L234基因即以其供体材料进行命名的Xa47(t)基因； 所述Xa47(t)G252为权利要求2 所述的Xa47(t)基因； 所述Xa47(t)YP基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.15所示； 所述Xa47(t )YP基因的CDS序列如SEQ  ID NO.30所示； 所述Xa47(t)HX基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438100 A 2所示； 所述Xa47(t)HX基因的CDS序列如SEQ  ID NO.32所示； 所述Xa47(t)L234基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO.27所示； 所述Xa47(t)L234基因的CD S序列如SEQ  ID NO.28所示。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114438100 A 3