(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210194915.5 (22)申请日 2022.03.01 (71)申请人 内蒙古农业大 学 地址 010018 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区昭乌达路3 06号 (72)发明人 徐晓静　谢梦圆　李文豪　陈烨馨　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 代理人 魏志恒 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门 氏 菌的引物探 针组合、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种同时检测产肠毒素大肠 杆菌和沙门氏菌的引物组、 试剂盒及应用， 涉及 病原菌检测技术领域。 同时检测产肠毒素大肠杆 菌和沙门氏菌的引物组、 试剂盒包括用于检测产 肠毒素大肠杆菌S T基因、 LT基因和用于检测沙门 氏菌invA 基因的引物和探针。 利用本发明可同时 实现产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌毒力基因的 检测， 检测灵敏度高、 特异性强、 重复性好， 适于 推广应用。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图20页 CN 114350829 A 2022.04.15 CN 114350829 A 1.一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合， 其特征在于， 所述引 物探针组合包括检测产肠毒素大肠杆菌ST基因和 /或LT基因， 和 沙门氏菌invA基因的引物 和探针； 所述检测产肠毒素 大肠杆菌ST基因的引物和探针包括： ST‑F： 5’ ‑GTCAACTGAATCACTTGACTCTTC‑3’， SEQ ID NO:1； ST‑R： 5’ ‑GCACAGGCAGGATTACAACAA‑3’， SEQ ID NO:2； ST‑P： 5’ ‑CAACTGAATCACTTGACTCTT‑3’， SEQ ID NO:3； 所述检测产肠毒素 大肠杆菌LT基因的引物和探针包括： LT‑F： 5’ ‑ATGGCTCCTCAGTCTAT TACAGA‑3’， SEQ ID NO:4； LT‑R： 5’ ‑GTCTCGGTCAGATATGTGAT TCTT‑3’， SEQ ID NO:5； LT‑P： 5’ ‑CCGGGACTTCGACCTGAAATGTTGC‑3’， SEQ ID NO:6； 所述检测沙门氏菌i nvA基因的引物和探针包括： invA‑F： 5’ ‑CACGCTCT TTCGTCTGGCATTA‑3’， SEQ ID NO:7； invA‑R： 5’ ‑TAGACAGGGCGGAGGACAAATC‑3’， SEQ ID NO:8； invA‑P： 5’ ‑CCTACCATACGGGCCATTTGTC‑3’， SEQ ID NO:9。 2.根据权利要求1所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组 合， 其特征在于， 所述ST ‑P探针5'端的荧光报告基团为CY5， 3'端的荧光淬灭基团为BHQ1； 所 述LT‑P 5'端的荧光报告基团为ROX， 3'端的荧光淬灭基团为BHQ2； 所述invA ‑P5'端的荧光 报告基团为H EX， 3'端的荧 光淬灭基团为BHQ3 。 3.一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品， 其特征在于， 包括核酸扩 增试剂， 所述核酸扩增试剂包括权利要求1或权利要求2所述的引物探针组合。 4.根据权利要求3所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品， 其 特征在于， 所述检测用品为试剂盒。 5.根据权利要求3或4所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品， 其特征在于， 使用时检测体系为25 μL， 且所述ST ‑F和ST‑R的终浓度均为160nmol/L， ST ‑P终 浓度为240nmol/L； 所述LT ‑F和LT‑R的终浓度均为200nmol/L， LT ‑P终浓度为280nmol/L； 所 述invA‑F和invA‑R终浓度均为280nmo l/L， invA‑P终浓度为320nmo l/L。 6.根据权利要求5所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品， 其 特征在于， 使用时检测体系为25μL， 还包括： Premix  Ex Taq 12.5μL， DNA模板2μL和余量 RNase‑free水。 7.根据权利要求3或4所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品， 其特征在于， 使用时的检测程序为： 预变性95℃20s； 变性95℃5s， 退火延伸54.5℃3 0s， 42个循环。 8.权利要求1或2所述引物探针组合或权利要求3 ‑6任一所述检测用品在制备检测产肠 毒素大肠杆菌和/或沙门氏菌的产品中的应用。 9.权利要求1或2所述引物探针组合或权利要求3 ‑6任一所述检测用品在检测产肠毒素 大肠杆菌和/或沙门氏菌中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350829 A 2一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组 合、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明属于病原菌检测技术领域， 具体涉及同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏 菌的引物探针组合、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]产肠毒素大肠杆菌(Enter otoxigenic  Escherichia  coli， ETEC)是造成牛腹泻的 主要病原之一， 其致病因子有很多， 首要致病因素是肠毒素， ETEC的肠 毒素包括2类： 耐热肠 毒素(ST)和不 耐热肠毒素(LT)。 ST免疫原性极低且不被LT或霍乱抗毒素中和， ST与GM1受体 结合后可刺激肠上皮细胞中的腺苷 酸环化酶(AC)的分泌， 使细胞质中的环磷酸腺苷(cAMP) 含量增高。 LT 是一种分子量较大的蛋白质， 其免疫原 性强， 是目前在人和 动物实验中鉴定出 的最有效的黏膜免疫原之一。 LT与GM1受体结合后刺激肠上皮细胞中的鸟腺苷酸环化酶的 分泌， 使细胞浆中的环磷酸鸟苷酸分泌 上升。 其致病机制是首先入侵机体的小肠， 依靠定植 因子定植、 增殖后产生肠毒素侵害机体细胞， 最终导致机体细胞的死亡。 沙门氏菌 (Salmonella)属肠道菌科， 其血清型有2600多种， 肠炎沙门氏菌是最具致病性的血清型。 沙 门氏菌是引起牛腹泻的主要病原菌， 主要感染7～28日龄 之间的犊牛， 主要表现症状为体温 升高、 水样粪便， 偶尔也可见粪便中出现黏膜出血随即迅速脱 水。 invA作为起重要的毒力基 因， 可作为PCR反应中的特异基因来设计特异性引物进行扩增。 [0003]目前， 研究人员已根据LT和ST研究出利用PCR对大肠杆菌的鉴定方法， 然而， 针对 引起牛腹泻的细菌性腹泻的最主要的两种病原(ETEC和沙门氏菌)需要分别进行PCR检测， 并且检测灵敏度低、 特异性差 。 [0004]因此， 如何提供一种同时检测 产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌， 且检测灵敏度高、 特 异性强的检测产品是本领域亟 待解决的问题。 发明内容 [0005]本发明公开了同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针 组合、 试剂盒及 应用。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]一种同时检测 产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针 组合， 所述引物探针 组合 包括检测产肠毒素 大肠杆菌ST基因和/或LT基因， 和沙门氏菌i nvA基因的引物和探针； [0008]所述检测产肠毒素 大肠杆菌ST基因的引物和探针包括： [0009]ST‑F： 5’ ‑GTCAACTGAATCACTTGACTCTTC‑3’， SEQ ID NO:1； [0010]ST‑R： 5’ ‑GCACAGGCAGGATTACAACAA‑3’， SEQ ID NO:2； [0011]ST‑P： 5’ ‑CAACTGAATCACTTGACTCTT‑3’， SEQ ID NO:3； [0012]所述检测产肠毒素 大肠杆菌LT基因的引物和探针包括： [0013]LT‑F： 5’ ‑ATGGCTCCTCAGTCTAT TACAGA‑3’， SEQ ID NO:4；说　明　书 1/11 页 3 CN 114350829 A 3