(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210206447.9 (22)申请日 2022.03.01 (71)申请人 江苏里下河地区农业科 学研究所 地址 225007 江苏省扬州市邗江区扬子江 北路568号 (72)发明人 陈梓春　肖宁　李爱宏　季红娟　 潘存红　周长海　蔡跃　李育红　 黄年生　张小祥　吴云雨　刘建菊　 时薇　余玲　王志平　 (74)专利代理 机构 江苏圣典律师事务所 32 237 代理人 杨文晰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种源于水稻RAmy1A基因的KASP引物组与 应用 (57)摘要 本发明公开了一种源于水稻RAmy1A基因的 KASP引物组与应用， 属于水稻遗传育种领域； 本 申请首次发现并验证了调控淀粉粘滞特性的新 等位基因型RAmy1AA， 其核苷酸序列第54bp处具 有显著的SNP位点A/C， 携带RAmy1AA等位基因型 的水稻的粘滞特性(PKV值)与食味值高于携带 RAmy1AC等位基因型的水稻品种； 本申请根据该 SNP位点设计KASP引物组， 能够应用于鉴别水稻 品种是否含有RAmy1AA等位基因， 可应用于筛选 粘滞特性较好的水稻品种， 提高食味品质； 本申 请提供KASP引物组具有准确性高、 简单快捷等优 点， 在改良稻米粘滞特性与食味品质的辅助育种 中具有重要的应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图4页 CN 114410827 A 2022.04.29 CN 114410827 A 1.一组源于水稻 RAmy1A基因的KASP引物组， 其特征在于， 所示引物组由核苷酸序列分 别如SEQ ID NO:2‑SEQ ID NO:4所示的引物组成。 2.如权利要求1所示引物组在水稻育种中的应用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述应用是指在筛选PKV值与食味值水稻中 的应用。 4.如权利要求3所述的应用， 其特 征在于， 所述应用具体步骤如下： 1） 获得待测样品基因 组DNA； 2） 以待测样品基因组DNA为模板， 以核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.2‑SEQ ID NO.4所示 的引物进行PCR扩增反应； 3） PCR扩增反应结束后， 收集每个反应孔产生的荧光信号， 若荧光信号为HEX， 则 待测样 品携带基因型为 RAmy1AA； 若荧光信号为FAM， 则待测样品携带基因型为 RAmy1AC； 若同时存在 两种信号， 则为杂合株系； 判定基因型为A的水稻样品的PKV 值与食味值高于基因型为C的水 稻样品。 5.如权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述PCR扩增 反应体系为： 20  ng/μL的DNA模 板 2.5 μL， 2 x KASP Master mix 2.5 μL， KASP Assay mix 0.07 μL； 每100 μL KASP Assay mix的制备方法为： 浓度为100 μM的引物SEQ  ID NO.2 12 μL、 浓度 为100 μM的引物  SEQ ID NO.3 12 μL、 浓度为100 μM的引物SEQ  ID NO.4 30 μL， ddH2O补足至 100 μL， 备用； PCR扩增程序： 94℃预变性15  min； 94℃变性20  s， 55℃ 60 s， 循环10次， 每循环降低 0.6℃； 94℃变性20  s， 55℃复性6 0 s， 循环26 次。 6.一种PCR  检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： 2  x KASP Master mix 2.5 μ L， KASP Assay mix 0.07 μL； 每100 μL KASP Assay mix的制备方法为： 浓度为100 μm的引物SEQ  ID NO.2 12 μL、 浓度 为100 μM的引物  SEQ ID NO.3 12 μL、 浓度为100 μM的引物SEQ  ID NO.4 30 μL， ddH2O补足至 100 μL， 备用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410827 A 2一种源于水稻RA my1A基因的KASP引物组与应用 技术领域 [0001]本发明属于水稻遗传 育种领域， 涉及水稻RAmy1A新等位基因型以及其KASP分子标 记引物组与应用。 背景技术 [0002]水稻是世界上最重要的粮食作物之一。 近年来， 随着生活水平的提高， 人们的消费 观也正从“吃的饱”向“吃的好”改变， 具有优良食味品质的稻米越来越受到消费市场的重视 (“2021.2020年我国水稻产业形势分析及2 021年展望[J] ”.徐春春等， 中国稻米,27(02):1 ‑ 4.)。 食味品质主要是指米饭的外观、 香味、 口感等， 通常用直链淀粉含量(Amylose   content,A C)、 糊化温度(Gel  Latinization  temperature,GT)、 胶稠 度、 粘滞特性和食味值 来表示(Zhou  H,Xia D,Zhao D,Li Y,Li P,et al.“The origin of Wxla provides  new  insights  into the improvement  of grain quality  in rice”.Journal  of  Integrative  Plant Biology,DOI:10.1 111/jipb.13 011.2020)。 [0003]稻米淀粉的粘滞 特性指稻米淀粉在加热糊化过程中的粘度变化， 与稻米的食味品 质密切相关， 可以用快速粘度分析仪(Rapid  visco analyzer,RVA)测定， 经过分析可以得 到热浆粘度(HPV)、 峰值粘度(PKV)、 冷胶粘度(CPV)、 消减值(SBV)、 崩解值(BDV)和回复值 (CSV)共6个主要特征值。 RVA特征值与稻米的食味品质呈现显著相关性， RVA特征值可以综 合反映稻米的食味品质 、 直链淀粉含量和胶稠度等特性， 前人研究表明PKV和BDV值与食味 品质呈现显著正相关， 而SBV和CSV与食味品质呈现显著负相关( “稻米淀粉RVA谱特征与品 质性状相关性研究. ”中国农业科学,38(4):657 ‑663,2005； Pan g Y,Ali J,Wang X,Franje   NJ,Revilleza  JE,et al.2016.Relationship  of rice grain amylose,gelatinization   temperature  and pasting properties  for breeding  better eating and cooking  quality of rice varieties.Plos  One,11(12):e0168483； Balet  S,Guelpa  A,Fox G, Manley M.2019.Rapid  Visco Analyser(RVA)as  a Tool for Measuring  Starch‑Related  Physiochemical  Properties  in Cereals:a  Review.Food  Analytical  Methods,12: 2344–2360.)。 稻米淀粉的粘滞特性受到多种因素的调控， PKV、 HPV和CPV均受到一个主效基 因即颗粒结合型淀粉合成酶基因Wx的调控， 直链淀粉含量(AC)会显著影响淀粉的粘滞特 性， 同时QTL定位结果显示SSIIIb、 GBSSII、 ISA1等淀粉合成相关基因可能与RVA谱密切相关 (Bao JS.2012.Toward  understanding  the genetic and molecular  bases of the  eating and cooking qualities  of rice.Cereal  Foods World,57(4):148 –156.； Tong   C,Chen Y,Tang F,Huang Y,Chen H,et al.2014.Genetic  diversity  of amylose  content and RVA pasting parameters  in 20rice accessions  grown in Hainan, China.Food  Chemistry,161:239 –245.； Chen  Z,Lu Y,Feng L,Hao W,Li C,et  al.2020.Genetic  Dissection  and Functional  Differentiation  of ALKa and ALKb, Two Natural Alleles of the ALK/SSIIa  Gene,Responding  to Low Gelatinization   Temperature  in Rice.Rice,13(1).)。 总体而言， 影响粘滞特性的因素研究较多， 但是其直说　明　书 1/6 页 3 CN 114410827 A 3