(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210200186.X (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 苏州科锐迈 德生物医药 科技有限公 司 地址 215123 江苏省苏州市中国 （江苏） 自 由贸易试验区苏州片区苏州工业园区 新平街38 8号腾飞科技园23 栋201单元 (72)发明人 侯强波　仇宗浩　赵阳　左炽健　 孙振华　 (74)专利代理 机构 北京林达刘知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11277 专利代理师 刘新宇　李茂家 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01)C12N 15/113(2010.01) C12N 15/66(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) (54)发明名称 基于翻译起始元件点突变的重组核酸分子 及其在制备环状RNA中的应用 (57)摘要 本公开涉及基于翻译起始元件点突变的重 组核酸分子及其在制备环状RNA中的应用， 具体 涉及用于制备环状RNA的重组核酸分子、 重组表 达载体、 环状RNA、 组合物、 制备环状RNA的方法、 在细胞内表达目标多肽的方法、 预防或治疗疾病 的方法， 编辑翻译起始元件序列的方法， 以及用 于编辑翻译起始元件序列的系统。 本公开提供的 重组核酸分子， 为环状RNA的体外制备提供了一 种结构新颖的Clean  PIE系统， 能够避免在环状 RNA中引入额外的外显子序列， 提高环状RNA分子 的序列精确度， 减小环 状RNA的二级结构的改变， 进而降低环状RNA的免疫原性， 在核 酸疫苗、 表达 治疗性蛋白、 基因治疗等领域具有良好的应用前 景。 权利要求书3页 说明书23页 序列表12页 附图13页 CN 114574483 A 2022.06.03 CN 114574483 A 1.一种用于制备环状RNA的重组核酸分子， 其中， 沿5 ’向3’的方向， 所述重组核酸分子 包括按如下顺序排列的元件： 内含子片段II， 翻译起始元件截断片段II， 编码至少一个目标多肽的编码元件， 翻译起 始元件截断片段I， 内含子片段I； 其中， 所述翻译起始元件截断片段I的3 ’末端包含核酶识别位点I， 所述核酶识别位点I 由位于所述翻译起始元件 截断片段I的3 ’端的第一预设数量的核苷酸组成； 所述翻译起始元件截断片段II的5 ’末端包含核酶识别位点II， 所述核酶识别位点II由 位于所述翻译起始元件 截断片段I I的5’端的第二预设数量的核苷酸组成； 所述翻译起始元件截断片段I的核苷酸序列与所述翻译起始元件截断片段II的核苷酸 序列沿5’向3’的方向用于形成翻译起始元件序列； 所述翻译起始元件截断片段I的核苷酸 序列对应所述翻译起始元件序列中靠近5 ’方向的部 分序列， 所述翻译起始元件截断片段II 的核苷酸序列对应所述翻译起始元件序列中靠 近3’方向的其 余部分序列； 所述内含子片段I的核苷酸序列与所述 内含子片段II的核苷酸序列沿5 ’向3’的方向用 于形成内含子序列； 所述内含子片段I的核苷酸序列包含所述内含子序列中靠近5 ’方向的 部分序列， 所述内含子片段II的核苷酸序列包含 所述内含子序列中靠近3 ’方向的其余部 分 序列。 2.根据权利要求1所述的重组核酸分子， 其中， 所述内含子片段I和所述内含子片段II 来源于I类内含子(Group  I Intron)， 所述核酶识别位点I来源于与所述内含子片段I的5 ’ 端连接的天然外显子序列， 所述核酶识别位点II来源于所述内含子片段II的3 ’端连接的天 然外显子序列； 可选地， 所述I类内含子来源于如 下任意一种的I类内含子： T4噬菌体td基因、 鱼腥藻属 tRNALeu、 TpaCOX2、 Ptu。 3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子， 其中， 所述第一预设数量的核苷酸选自3 ‑ 100个核苷酸， 优选 3‑50个核苷酸， 更优选 3‑10个核苷酸。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述第二预设数量的核苷酸选 自1‑100个核苷酸， 优选1 ‑50个核苷酸， 更优选1 ‑10个核苷酸。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述第一预设数量与所述第二 预设数量的和不 等于3y， y≥1且y为整数。 6.根据权利要求1 ‑5任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述翻译起始元件序列为具有 起始所述编码元件翻译的活性的序列； 可选地， 所述翻译起始元件序列包含如下所述序列中的一项或两项以上的组合： IRES 序列、 5’UTR序列、 Kozak序列、 包 含m6A修饰的序列、 核糖 体18S rRNA的互补序列。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述编码元件包含至少一个编 码区； 可选地， 所述编码元件包含至少两个编 码区， 每个编码区彼此独立地编码任意类型的 目标多肽。 8.根据权利要求7所述的重组核酸分子， 所述编码元件包含至少两个编码区， 其中， 任 意相邻的两个编码区之间连接有连接 子； 优选地， 所述连接 子为编码2 A肽的多核苷酸。 9.根据权利要求7所述的重组核酸分子， 所述编码元件包含至少两个编码区， 其中， 任权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114574483 A 2意相邻的两个编码区之间连接有翻译起始元件； 可选地， 位于任意相邻的两个编码区之间的翻译起始元件包含如下所示序列中的一项 或两项以上的组合： IRES序列、 5 ’UTR序列、 Kozak序列、 包含m6A修饰的序列、 核糖体18S   rRNA的互补序列。 10.根据权利要求1 ‑9任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述目标多肽为人源蛋白或 非人源蛋白； 可选地， 所述目标多肽选自如下的一种或两种以上的组合： 抗原、 抗体、 抗原结合片段、 荧光蛋白、 具有疾病治疗活性的蛋白、 具有基因编辑活性的蛋白。 11.根据权利要求1 ‑10任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述重组核酸分子还包括插 入元件， 所述插 入元件位于所述编码元件与所述翻译起始元件 截断片段I之间； 所述插入元件选自如下(i) ‑(iii)组成组中的至少一项： (i)转录水平调控元件， (i i)翻译水平调控元件， (i ii)纯化元件； 可选地， 所述插 入元件包含如下的一种或两种以上的组合的序列： 非翻译区序列， po lyA序列， 适配 体序列， 核糖开关序列， 结合 转录调控因子的序列。 12.根据权利要求1 ‑11任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述重组核酸分子还包括5 ’ 同源臂和3 ’同源臂， 所述5 ’同源臂的核苷酸序列 与所述3’同源臂的核苷酸序列杂交； 所述5’同源臂连接于所述 内含子片段II的5 ’端， 所述3 ’同源臂连接于所述 内含子片段 I的3’端。 13.根据权利要求1 ‑12任一项所述的重组核酸分子， 其中， 所述内含子片段I、 所述编码 元件和所述内含子片段II中的任意一个元件的内部不包含来源于外显子的核苷酸序列； 或 者， 所述内含子片段I、 翻译起始元件截断片段II、 所述编码元件、 翻译起始元件截断片段I 和所述内含子片段I I中的任意两个元件之间不包 含来源于 外显子的核苷酸序列。 14.一种重组表达载体， 其中， 所述重组表达载体包含如权利要求1 ‑13任一项所述的重 组核酸分子 。 15.根据权利要求1 ‑13任一项所述的重组核酸分子， 或根据权利要求14所述的重组表 达载体在体外制备环状RNA的用途。 16.一种在体外制备环状RNA的方法， 其包括如下步骤： 转录步骤： 如权利要求1 ‑13任一项所述的重组核酸分子或根据权利要求14所述的重组 表达载体转录形成环化前体核酸分子； 环化步骤： 所述环化前体核酸发生环化反应， 得到环状RNA； 可选地， 所述方法还 包括， 纯化所述环状RNA的步骤。 17.根据权利要求1 ‑13任一项所述的重组核酸分子、 根据权利要求14所述的重组表达 载体， 或根据权利要求16所述的方法制备的环状RNA。 18.一种环状RNA， 沿5 ’向3’方向， 其包 含按如下顺序排列的元件： 翻译起始元件， 编码至少一个目标多肽的编码元件； 可选地， 所述环状RNA包含位于所述翻译起始元件 的5’端与所述编码元件 的3’端之间 的插入元件； 可选地， 所述翻译起始元件、 所述目标多肽或所述插入元件如权利 要求6、 10 ‑11任一项 所定义。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114574483 A 3