(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210199698.9 (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 内蒙古农业大 学 地址 010018 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区昭乌达路3 06号 (72)发明人 周伟光　赵润涛　张志丹　 悉尼尼根　王旭芬　侯琳　张贺　 赵洋　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 崔自京 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检 测引物、 探 针及应用 (57)摘要 本发明公开了一种牛纽布病毒TaqMan荧光 定量RT‑PCR检测引物、 探针及应用。 属于生物检 测技术领域。 包 括： 引物NB ‑F‑4716、 NB‑R‑4949和 探针NBV‑TZ。 本发明最佳上下游引物浓度均为 500nmol/L， 探针浓度为400nmol/L， 在1 ×108～1 ×101copies/μL之间呈现良好的线性关系， 线 性相关系数R2＝0.996， 扩增效率为105.9％； 特 异性较强， 敏感性较高， 对BNeV质粒标准品最低 检测下限为1 ×101copies/μL， 重复性较好， 组 内变异系数和组间变异系数均小于3％； 为BNeV 的检测和分子流行病学调查 提供了有力的手段。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 114703321 A 2022.07.05 CN 114703321 A 1.一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT ‑PCR检测引物， 其特征在于， 包括： 引物NB ‑F‑ 4716， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 引物NB ‑R‑4949， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.如权利要求1所述的检测引物， 其特征在于， 还包括探针NBV ‑TZ， 核苷酸序列如SEQ   ID NO.3所示。 3.含有权利要求2所述引物的试剂或试剂盒。 4.一种非诊断治疗目的使用TaqMan荧光定量RT ‑PCR检测牛纽布病毒的方法， 其特征在 于， 使用权利要求2所述的引物。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 包括扩增体系： GoTaq  Probe qPCRMaster   Mix 10 μL， ScriptTMRT ‑MIX for 1‑Step RT‑qPCR 2×0.4 μL， 10 μmol/L上下游引物各1μL， 10 μmol/L探针0.8 μL， cDNA模板2 μL， 余 量RNase‑Free ddH2O， 总体积为20 μL。 6.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 包括扩增程序： 45℃反转录15min； 95℃预变 性2min； 95℃变性15s， 5 5℃退火3 0s， 72℃延伸3 0s， 共45个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703321 A 2一种牛纽布 病毒TaqMa n荧光定量RT ‑PCR检测引物、 探针及 应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技术领域， 更具体的说是涉及一种牛纽布病毒TaqMan荧光定 量RT‑PCR检测引物、 探针及应用。 背景技术 [0002]纽布病毒(Nebovirus， NeV)是杯状病毒科、 纽布病毒属的唯一成员， 同科的病毒还 有诺如病 毒属(Norovirus)、 札幌病 毒属(Sapovirus)、 水疱疹病 毒属(Vesivirus)、 兔病 毒 属(Lagovirus)。 [0003]NeV为无囊膜单股正链RNA病毒， 基因组全长约为7.4kb， 由两个开放的阅读框 (ORFs)组成， 分为三种基因型： NB、 NA1和DijonA216。 纽布病毒的易感动物只有牛， 可诱发犊 牛厌食症和木糖吸收不良， 尽管目前尚无NeV的分离培养体系， 但在排除了其他病毒的含 NeV腹泻粪便无菌处理后感染新生无菌小 牛， 可引起严重腹泻和肠道损伤， 尤其在十二指肠 和空肠最 为严重。 [0004]目前已在美国、 英国、 巴西以及我国犊牛粪样检测出了BNeV， 其分子生物学检测方 法有SYBR  Green荧光定量RT ‑PCR检测方法、 TB  Green荧光定量RT ‑PCR检测方法， 巢氏RT ‑ PCR检测方法、 常规RT ‑PCR检测方法， 尚未见TaqMan荧光定量RT ‑PCR检测牛纽布病毒的报 道。 [0005]因此， 如何提供一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT ‑PCR检测引物及检测方法、 体 系， 提供更为准确的结果是本领域 技术人员亟需解决的问题。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明提供了一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT ‑PCR检测引物、 探针 及应用。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0008]一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT ‑PCR检测引物， 包括： 引物NB ‑F‑4716， 核苷酸 序列如SEQ  ID NO.1所示； 引物NB ‑R‑4949， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 [0009]优选的： 还 包括探针NBV ‑TZ， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 [0010]本发明还提供了含有上述引物的试剂或试剂盒。 [0011]本发明还提供了一种非诊断治疗目的使用TaqMan荧光定量RT ‑PCR检测牛纽布病 毒的方法， 使用上述的引物。 [0012]优选的包括扩增体系： GoTaq  Probe qPCRMaster  Mix 10 μL， ScriptTMRT ‑MIX for  1‑Step RT‑qPCR 2×0.4 μL， 10 μmol/L上下游引物各1μL， 10 μmol/L探针0.8 μL， cDNA模板2 μ L， 余量RNase‑Free ddH2O， 总体积为20 μL。 [0013]优选的： 包括扩增程序： 45℃反转录15 min； 95℃预变性2min； 95℃变性15s， 55℃退 火30s， 72℃延伸3 0s， 共45个 循环。说　明　书 1/6 页 3 CN 114703321 A 3