(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210199932.8 (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 中国热带农业科 学院椰子 研究所 地址 571339 海南省文昌市文清大道496号 (72)发明人 王永　李静　杨耀东　吴翼　肖勇　 刘蕊　张璐璐　曾春茹　 (74)专利代理 机构 深圳市千纳专利代理有限公 司 44218 专利代理师 张新蕊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴别香水椰子的I nDel标记及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种用于鉴别香水椰子的 InDel标记及其应用， 其中， InDel标记引物对如 SEQ ID No.1‑2所示、 如SEQ  ID No.3‑4所示、 如 SEQ ID No.5‑6所示或如SEQ  ID No.7‑8所示， InDel标记引物组由上述引物对中的两种或两种 以上组成。 采用所述的InDel标记引物对或InDel 标记引物组可以制备用于香水椰子鉴别的试剂 盒。 采用本发明的InDel标记引物对或InDel标记 引物组或试剂盒对不同品种椰子进行PCR扩增电 泳， 即可根据电泳条带或者测序结果鉴别出香水 椰子品种， 可 以在苗期到成年大树中随时检测， 鉴定准确率高， 对于区分香水椰子具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114438254 A 2022.05.06 CN 114438254 A 1.用于鉴别香水椰子的InDel标记， 其特征在于， 所述InDel标记的引物对如SEQ  ID  No.1‑2所述引物对、 如SEQ  ID No.3‑4所述引物对、 如SEQ  ID No.5‑6所述引物对或者如SEQ   ID No.7‑8所述引物对。 2.一种用于鉴别香水椰子的InDel标记引物组， 其特征在于， 所述InDel标记引物组由 以下引物对 中的两种或两种以上组成： 如SEQ  ID No.1‑2所述引物对、 如SEQ  ID No.3‑4所 述引物对、 如SEQ  ID No.5‑6所述引物对、 如SEQ  ID No.7‑8所述引物对。 3.一种用于鉴别香水椰子的试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1所述的InDel标记 引物对或者权利要求2所述的I nDel标记引物组。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 其还包括进行PCR反应和/或电泳所需的 试剂。 5.权利要求1所述的InDel标记引物对或者权利要求2所述的InDel标记引物组或者权 利要求3或4所述的试剂盒在鉴别香水椰子中的应用。 6.一种鉴别香水椰子的方法， 其特征在于， 采用权利要求1述的InDel标记引物对或者 权利要求2所述的I nDel标记引物组或者权利要求3或4所述的试剂盒进行。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取椰子叶片 DNA； (2)采用I nDel标记引物对或I nDel标记引物组或试剂盒对椰子叶片 DNA进行PCR扩增； (3)对扩增结果进行凝胶电泳检测； (4)根据检测结果对不同品种椰子进行鉴别， 凝胶电泳结果显示存在插入或缺失片段 导致电泳或者测序结果大于或小于目的条带或目的片段的是香水椰子， 而电泳或者测序结 果与目的条 带或目的片段 大小一致的是其 他品种椰子， 其中： 当所述InDel标记引物对为如SEQ  ID No.1‑2所示引物对时， 目的条带或目的片段为 144bp； 当所述InDel标记引物对为如SEQ  ID No.3‑4所示引物对时， 目的条带或目的片段为 123bp； 当所述InDel标记引物对为如SEQ  ID No.5‑6所示引物对时， 目的条带或目的片段为 139bp； 当所述InDel标记引物对为如SEQ  ID No.7‑8所示引物对时， 目的条带或目的片段为 109bp。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取香水椰子叶片 DNA； (2)采用InDel标记引物对或InDel标记引物组或试剂盒对香水椰子叶片DNA进行PCR扩 增； (3)对PCR产物进行聚丙烯酰胺胶电泳检测， 并用胶回收试剂盒进行回收； (4)回收产物进行PCR扩增后将PCR产物进行 纯化， 连接转 化后挑单 克隆测序； (5)根据测序结果以高种 椰子基因组为参照对香水椰子测序序列进行Blast比对， 存在 插入片段的是香水椰子 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438254 A 2用于鉴别香水椰子的InDel标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学及生物信息学领域， 具体涉及用于鉴别香水椰子的InDel 标记及其应用。 背景技术 [0002]椰子(Cocos  nueifem L.)是棕榈科椰子属中唯一的一个种， 属于单子叶多年生常 绿乔木， 其浑身 是宝， 被誉为 “生命之树 ”是热带地区重要的木本油料作物和食品能源作 物， 经济寿命达40 ‑80年， 自然 寿命可达10 0年以上。 [0003]按照常规分类方法可将椰子分为高种椰子、 矮种椰子以及介于高种和矮种之间的 中间类型。 其中高种椰子的主要特征为植株高大， 椰干基部膨大呈 “葫芦头”， 异花授粉； 而 矮种椰子植株矮小， 椰干基部没有 “葫芦头”， 自花授粉， 经济寿命和自然寿命较短； 中间类 型则介于以上两者之间。 此外， 在各类变种中根据果实大小、 果实形状和果皮颜色等， 又将 椰子种质资源分为若干类型， 例如矮种椰子可根据果皮颜色 分为黄矮、 红矮和绿 矮。 [0004]香水椰子(Aromatic  Green Dwarf,AROD)是绿矮椰子中的一个特异突变种， 原产 于泰国塞西， 其最大特色是椰子叶片和椰子水闻起来有类似香芋香味的特殊香味。 使其在 市场上备 受欢迎， 据统计， 具有香味的椰子的价格是不具有香味的椰子的两倍。 香水椰子种 植3～4年后开花结果， 结果较早， 种植8年后是高产期， 约有60年的自然寿命， 35年左右的经 济寿命， 它的产量高， 平均每株产8 0个以上， 最高产的可达150多个。 果 实呈圆形， 较小， 果实 围径37～45cm， 果长18.2cm、 宽15.6cm， 椰肉厚9.2mm。 单果重1.2kg， 外皮占35％， 椰壳占 13％， 椰肉占32％， 椰子水占20％。 果皮呈绿色， 果皮和种壳较薄。 香水椰子含糖量高， 椰肉 松软滑嫩， 营养 十分丰富， 是极佳的天然绿色食品之一。 [0005]InDel标记(Insertion ‑Deletion)是在全基因组重测序的基础上开发的， 是等位 基因位点上DNA插入或缺失一段短序列产生的多态性变异。 简单来说就是两个亲本在全基 因组中的差异， 对于其中的一个亲本基因组， 另外一个亲本中有一定数量的核苷酸的插入 或者缺失， 可以根据基因组中插入或缺 失的位点， 设计扩增这些位点的PCR引物， 就是InDel 标记。 [0006]InDels广泛分布在整个基因组中， 与其它的分子标记相比， 在基因组的相同位置 出现相同大小的InDel标记的几率很小， 避免了后续分析的模糊性。 在基因组序列测定的基 础上， InDel标记可以通过生物信息学的方法方便简单地获得。 与SSR标记相比， InDel标记 的扩增产物带型清晰简单， 稳定性和产物分离效果均优于SSR标记。 InDel标记具有其它分 子标记的优点。 基于全基因组重测序的InDel标记， 具有在基因组内分布广、 密度高、 多态 性 强、 检测容易、 分型系统简单、 遗传稳定。 InDel标记适用于全基因组分子标记的开发， 目前 已开始应用于动植物群体遗传分析、 构建高密度分子标记遗传图谱和基因定位、 生物的遗 传多样性分析、 分子 辅助育种以及人类法医遗传学、 医学诊断等领域。说　明　书 1/5 页 3 CN 114438254 A 3