(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210199566.6 (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 西南民族大 学 地址 610000 四川省成 都市武侯区一环路 南四段16号 (72)发明人 岳华　汤承　陈雪蓉　 (74)专利代理 机构 成都华风专利事务所(普通 合伙) 51223 专利代理师 杜朗宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测非洲猪瘟病毒的引物、 探针、 试剂盒和 iiPCR方法 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测领域， 公开了检 测非洲猪瘟病毒的引物、 探针、 试剂盒和iiPCR方 法； 其中， 所述引物分为上游引物和下游引物， 上 游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游 引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 探针的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述试剂盒包 括所述引物和探针。 本发明试剂盒检测时间短， 反应时间仅42分钟， 且特异性强、 灵 敏度高、 便于 储存， 配合恒温隔绝式PCR仪使用， 能够满足现场 和野外环 境下对非洲猪瘟病毒的快速检测需要， 具有重要的临床使用价值， 可以在基层广泛推 广。 权利要求书2页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 114540549 A 2022.05.27 CN 114540549 A 1.一种检测非洲猪瘟病 毒的引物和探针， 其特征在于， 包括检测非洲猪瘟病 毒的引物、 探针； 所述引物分为上游引物和下游引物， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游 引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.根据权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 探针的核苷酸序列的5'端连接有荧 光基团， 3'端连接有非荧 光淬灭基团和淬灭基团； 所述荧光基团选自FAM、 TET、 H EX、 CY3、 JOE中的一种， 进一 步为FAM； 淬灭基团选自MGB、 BHQ1、 BHQ2、 TAMRA、 DABC YL、 Eclipse中的一种， 进一 步为MGB。 3.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1或2所述的引物和探 针。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括反应缓冲液、 Taq酶、 反转录酶、 阳性对照品和阴性对照品、 dNTPs。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 反应缓冲液由以下组分构成： 500mMKCl、 100mMTris‑HCl、 15mM MgCl2， 加ddH2O至体积总量 为3ml， pH 8.0～8.5 。 6.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， Taq酶的终浓度为5U ·μL‑1， 反转录酶的 终浓度为20U ·μL‑1。 7.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 阳性对照品为含有非洲猪瘟病毒DNA片 段的样品； 进一步地， 阳性对照品通过以下方法制备得到： 将含有非洲猪瘟病毒DNA片段的DNA样 品100 μL装入PCR管内， 降温至 ‑40～‑80℃， 然后在8～12pa气压下冻干形成干粉状。 8.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 阴性对照品为无非洲猪瘟病毒DNA片段 的样品； 进一步地， 阴性对照品通过以下方法制备得到： 将无非洲 猪瘟病毒DNA片段的样品100 μ L装入PCR管内， 降温至 ‑40～‑80℃， 然后在8～12pa气压下冻干形成干粉状。 9.根据权利要求3～8任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 非洲猪瘟病毒的上游引物和 下游引物的终浓度均为10 μmo l·μL‑1， 探针的终浓度为10 μmo l·μL‑1； dNTPs的终浓度为2.5mM 。 10.一种检测非洲猪瘟病毒的i iPCR方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)制备DNA模板： 提取非洲猪瘟病毒的总DNA， 制备 得到DNA模板； 2)建立iiPCR反应 体系： 取100 μL反应缓冲液加入到阳性对照品中混合， 制备得到阳性对照品， 然后取50 μL反应 缓冲液和5 μL阳性对照品加入荧 光定量PCR反应液冻干管中， 制备 得到阳性对照反应 体系； 取100 μL反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中， 制备得到阴性对照品， 然后取50 μL反应 缓冲液和5 μL阴性对照品加入荧 光定量PCR反应液冻干管中， 制备 得到阴性对照反应 体系； 取50μL反应缓冲液和5μL检测样本DNA加入荧光定量PCR反应液冻干管中， 制 备得到检 测样本DNA反应 体系； 然后分别从各个反应 体系中取5 0 μL混合物 移入恒温隔绝式荧 光PCR反应管中； 将制备好的荧 光定量PCR反应管瞬时高速 离心5s， 避免出现气泡；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114540549 A 23)扩增检测： 把PCR反应管放置于恒温隔绝式荧光PCR仪器反应， 结果显示 “+”表示阳 性，“‑”表示阴性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114540549 A 3