(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210199446.6 (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 秦皇岛海关技 术中心 地址 066004 河北省秦皇岛市开发区六盘 山路1号 (72)发明人 柳吉芹　贾宁　王海洋　钱云开　 王立杉　高飞　单超　吴曦　 (74)专利代理 机构 焦作加贝专利代理事务所 (普通合伙) 41182 专利代理师 冯新志 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 圆苞车前子壳DNA的提取及分子鉴别 (57)摘要 本发明提供了一种圆苞车前子壳DNA的提取 及分子鉴别， 提取方法， 其包括： 称取圆苞 车前子 壳粉末， 并依次加入CTAB裂解液和蜗牛酶， 37℃ 水浴裂解1 ‑2h， 65℃裂解1 ‑2h， 抽提之后， 取上 清， 加入CTAB沉淀 液， 室温静置， 离心， 弃上清， 加 入氯化钠溶液， 抽提之后， 取上清， 加入异丙醇， 沉淀， 离心， 弃上清， 用乙醇洗涤沉淀， 再加入去 离子水溶解； 本发明在细胞裂解阶段， 加大CTAB 裂解液的体积， 加入蜗牛酶促进细胞裂解， 可 以 获得高质量的核酸， 通过ITS2和psbA ‑trnH基因 扩增、 测序比对， 实现了对圆苞车前子壳的分子 鉴别， 同时为圆苞车 前子壳掺 假提供技术依据。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114438170 A 2022.05.06 CN 114438170 A 1.一种圆苞车 前子壳DNA的提取 方法， 其特 征在于： 其包括： 称取圆苞车前子壳粉末， 并依次加入CTAB裂解液和蜗牛酶， 37℃水浴裂解1 ‑2h， 65℃裂 解1‑2h， 抽提之后， 取上清， 加 入CTAB沉淀液， 室温静置， 离心， 弃上清， 加 入氯化钠溶液， 抽 提之后， 取 上清， 加入异丙醇， 沉淀， 离心， 弃 上清， 用乙醇洗涤沉淀， 再加入去离 子水溶解。 2.根据权利要求1所述的圆苞车前子壳DNA的提取方法， 其特征在于： 所述CTAB裂解液 包括CTAB、 Tris ‑HCl、 乙二胺四乙酸(EDTA)和氯化钠(NaCl)。 3.根据权利要求1所述的圆苞车前子壳DNA 的提取方法， 其特征在于： 所述蜗牛酶由纤 维素酶、 半纤维素酶、 果胶酶、 阿尔法淀粉酶、 甘露糖酶、 蔗糖酶、 半乳聚糖酶、 蛋白水解酶和 氨基酸转移酶组成。 4.根据权利要求1所述的圆苞车前子壳DNA 的提取方法， 其特征在于： 所述离心的转速 为11000‑13000rpm， 离心的时间为8 ‑13min。 5.根据权利要求1所述的圆苞车前子壳DNA 的提取方法， 其特征在于： 所述沉淀的温度 为3‑5℃， 沉淀的时间为0.5 ‑1.5h。 6.一种圆苞车 前子壳DNA， 其特 征在于： 其由权利要求1 ‑5任一项所述的提取 方法得到 。 7.一种如权利要求6所述的圆苞车 前子壳DNA的分子鉴别方法， 其特 征在于： 其包括： 以圆苞车前子壳DNA为模板， 用ITS2和psbA ‑trnH基因引物进行PCR扩增， PCR产物通过 琼脂糖凝胶电泳检测。 8.根据权利要求6所述的圆苞车前子壳DNA的分子鉴别方法， 其特征在于： 所述ITS2基 因的正向引物序列如SEQ  ID NO.1所示， 反向引物序列如SEQ  ID NO.2所示。 9.根据权利要求6所述的圆苞车前子壳DNA的分子鉴别方法， 其特征在于： 所述psbA ‑ trnH基因的正向引物序列如SEQ  ID NO.3所示， 反向引物序列如SEQ  ID NO.4所示。 10.根据权利要求6所述的圆苞车前子壳DNA的分子鉴别方法， 其特征在于： 所述PCR反 应中反应程序为： 95℃、 5min； 95℃、 30s， 56℃、 35s， 72℃、 30s， 共40个循环； 72℃、 5min； 4℃ 保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438170 A 2圆苞车前子壳DNA的提取及分子鉴别 技术领域 [0001]本发明属于生物提取技术领域， 具体涉及一种圆苞车前子壳DNA的提取及分子鉴 别。 背景技术 [0002]圆苞车前(Plantago  ovata， 又名洋车前)是车前科车前属的一种草药， 原产于印 度、 伊朗， 在地中海地区如法国、 西班牙 等国亦有栽培， 其中印度产的质量最好。 圆苞车前子 壳是人工种植的圆苞车前种子的外壳， 因富含膳食纤维， 被广泛应用于药品、 保健品、 食品、 饮料以及饲料产品中。 2014 年， 国家卫计委批准圆苞车 前子壳为 新食品原料。 [0003]圆苞车前子壳富含黏胶质， 由树胶醛醣、 木糖、 半乳胶醛酸、 半干燥脂肪油及少量 珊瑚木苷组成。 圆苞车前子壳中富含膳食纤维， 含量高达8 0％以上， 而其中可溶性膳食纤维 与不溶性膳食纤维的比例高达7: 3； 其他营养成分主要包括葡萄糖甙、 蛋白质、 多糖、 维生素 B1和胆碱 。 [0004]圆苞车前的种子是可利用的部分， 种子外壳中的多糖分子能够很快吸收水分， 在 小肠中吸水形成糊状团块， 可改善粪便与肠壁的润滑条件， 促进排便速度， 故圆苞车前常被 用来润肠排便。 在印度的传统疗法中， 圆苞车前用于治疗便秘、 腹泻、 痔疮、 溃疡、 膀胱毛病 和高血压 。 圆苞车前也常用于抗皮肤刺激， 包括常春藤 毒性反应及昆虫叮咬。 [0005]其它车前属植物如车前Plantago  asiatica、 平车前P.depressa、 长叶车前 P.lanceolata和大车前P.major等， 其膳食纤维含量低， 销售价格也低， 外观形态与圆苞车 前差异不大， 存在假冒圆苞车前的可能。 因此急需一种快速准确的鉴定方法， 以保护消费者 的合法权益和维护市场秩序。 [0006]DNA条形码技术是当今生物分类和鉴定的研究热点和方向， 该技术简便高效， 不受 样品形态限制。 车前属植物均具有药用价值， 依据 《中国药典》 中 《中药材DNA条形码分子鉴 定指导原则》 ， 我们利用ITS2和psbA ‑trnH基因对圆苞车前进 行分子鉴定。 此外， 由于圆苞车 前子壳中富含80％以上的膳食纤维， 故用常规方法难以提取核酸DNA， 故对DNA提取方法进 行了探索。 发明内容 [0007]针对现有技术中的不足， 本发明的目的是提供一种圆苞车前子壳DNA的提取及分 子鉴别。 [0008]为达到上述目的， 本发明的解决方案是： [0009]一种圆苞车 前子壳DNA的提取 方法， 其包括： [0010]称取圆苞车前子壳粉末， 并依次加入CTAB裂解液和蜗牛酶， 37℃水浴裂解1 ‑2h， 65 ℃裂解1‑2h， 抽提之后， 取上清， 加入CTAB沉淀液， 室温静置， 离心， 弃上清， 加入氯化钠溶 液， 抽提之后， 取上清， 加入异丙醇， 沉淀， 离心， 弃上清， 用乙醇洗涤沉淀， 再加入去离子水 溶解。说　明　书 1/4 页 3 CN 114438170 A 3