(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210198175.2 (22)申请日 2022.03.02 (66)本国优先权数据 202210076610.4 202 2.01.24 CN (71)申请人 广州迪澳基因科技有限公司 地址 510000 广东省广州市黄埔区科丰路 31号G12栋 603房 (72)发明人 申洪杰　刘浩　 (74)专利代理 机构 广州博联知识产权代理有限 公司 44663 专利代理师 宋佳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群 的方法及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物检测领域， 具体涉及一种基 于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法 及试剂盒。 本发明提供一种多重引物， 其包括结 核分枝杆菌插入序列IS6110、 MPB64基因、 rpoB基 因、 katG基因、 inhA基因和gyrA基因的特异性引 物对和特异性探针。 本发明还提供了相应的试剂 盒和检测方法。 本发明的检测方法可快速鉴别结 核杆菌复合菌群， 可 以同时判定其对异烟肼、 利 福平和氟喹诺酮类药物的耐药性， 具有良好的应 用前景。 权利要求书3页 说明书10页 序列表4页 附图4页 CN 114480691 A 2022.05.13 CN 114480691 A 1.一种检测结核分枝杆菌复合菌群的多重引物， 其特征在于， 所述多重引物包括插入 序列IS6110、 MPB64基因、 rpoB基因、 katG基因、 inhA基因和gyrA基因的特异性引物对； 所述 特异性引物对的序列为： F‑IS6110： CTCAGCG GATTCTTCGGTCGTGGTC(SEQ ID NO： 1)； R‑IS6110： TGAGGTCGCCCGTCTACT TGGTGTT(SEQ ID NO： 2)； F‑MPB64： ACATCAGC CTGCCCAGTTACTACCC(SEQ ID NO： 3)； R‑MPB64： TCAGC CTGCCACAGCGTGTCATA(SEQ  ID NO： 4)； F‑rpoB： TGGAGGCGATCACAC CGCAGAC(SEQ  ID NO： 5)； R‑rpoB： GTGCACGTCGCG GACCTCCAGCC(SEQ ID NO： 6)； F‑katG： TGGAGCAGATG GGCTTGGG(SEQ ID NO： 7)； R‑katG： CCAGCAGGGCTCTTCGTCA(SEQ  ID NO： 8)； F‑inhA： CGGAAATCGCAGC CACGTTAC(SEQ ID NO： 9)； R‑inhA： ACGGGATACGAATGGGGGTTTG(SEQ ID NO： 10)； F‑gyrA： GCAATGTTCGATTCCGGCTTCC(SEQ ID NO： 11)； R‑gyrA： CGGGCTTCGGTGTACCTCAT(SEQ  ID NO： 12)。 2.如权利要求1所述的多重引物， 其特征在于， 所述多重引物还包括插入序列IS6110、 MPB64基因、 rpoB基因、 katG基因、 i nhA基因和gyr A基因的特异性探针； 优选地， 所述特异性探针的序列为： P‑IS6110： CGGCGCACCCACTTACGCCG(SEQ ID NO： 13)； P‑MPB64： CTG GAAAATTACATCGC CCAG(SEQ ID NO： 14)； P1‑rpoB： CAT TGGCACCAGCCAGCTGAGC CAATG(SEQ ID NO： 15)； P2‑rpoB： CCTGCTTCATGGACCAGAACAACCCGCTGGCAGG(SEQ ID NO： 16)； P3‑rpoB： CCTGCTCGGGGTTGACCCACAAGCGCGCAG G(SEQ ID NO： 17)； P4‑rpoB： CCATGGCGACTGTCG GCGCTGCCATGG(SEQ ID NO： 18)； P‑katG： CCTGCGGACGCGATCAC CAGCGGCAGCAGG(SEQ ID NO： 19)； P‑inhA： CCTGCCCCGACAACCTATCGTCTCGC CGCAGG(SEQ ID NO： 20)； P1‑gyrA： CGACCGCAGCCACGCCAAGTCGGTC(SEQ ID NO： 21)； P2‑gyrA： CCCCGTTCAGTTGCCGAGACCATGGGG(SEQ ID NO： 22)； P3‑gyrA： CCTGCCAACTACCACCCGCACGGCGACGCG GCAGG(SEQ ID NO： 23)； P4‑gyrA： CCTGCTCGATCTACGACAGC CTGGTGCGGCAGG(SEQ ID NO： 24)； P5‑gyrA： CATGGCCCTGCCCTGGTCGCTGCGC CATG(SEQ ID NO： 25)。 3.如权利要求2所述的多重引物， 其特征在于， 所述特异性探针的5 ’端修饰有荧光基 团， 选自下组FAM、 HEX、 ROX、 CY5、 Cy3、 TET、 JOE、 VIC； 所述特异性探针 的3’端修饰有淬灭基 团， 选自下组BHQ、 Dabcy1、 TAMRA、 MGB。 4.如权利要求2所述的多重引物， 其特征在于， 所述特异性探针包含以下修饰中的一种 或两种： 修饰为肽核酸(PNA)、 锁核酸(L NA)； 优选地， 以下 特异性探针中， 标有下划线的碱基修饰为锁核酸(L NA)： P1‑rpoB： CAT TGGCACCAGCCAGCTGAGC CAATG； P2‑rpoB： CCTGCTTCATGGACCAGAACAACCCGCTGGCAGG；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114480691 A 2P‑inhA： CCTGCCCCGACAACCTATCGTCTCGC CGCAGG； P2‑gyrA： CCCCGTTCAGTTGCCGAGACCATGGGG。 5.权利要求1 ‑4任一项多重引物在以下(i)或(i i)中的应用： (i)在检测结核分枝杆菌复合菌群中的应用， 其包括以待测样本的DNA为模板， 利用所 述多重引物进行扩增 和熔解曲线检测； (ii)在制备检测结核分枝杆菌复合菌群的试剂中的应用。 6.一种检测结核分枝杆菌 复合菌群的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括dNTPs、 DNA 聚合酶、 (NH4)2SO4、 MgCl2、 KCl、 Tris ‑HCl、 权利要求1 ‑4任一项所述的多重引物； 优选地， 所述试剂盒包括体系A、 体系B和DNA聚合酶， 所述体系A包括： dNTPs、 (NH4)2SO4、 MgCl2、 KCl、 Tris ‑HCl、 F‑IS6110、 R ‑IS6110、 F ‑MPB64、 R‑MPB64、 F‑rpoB、 R‑rpoB、 F‑katG、 R‑ katG、 F‑inhA、 R‑inhA、 F‑gyrA、 R‑gyrA、 P‑IS6110、 P ‑MPB64、 P1 ‑rpoB、 P3‑rpoB、 P‑katG、 P‑ inhA、 P2‑gyrA、 P4‑gyrA； 所述体系B包括： dNTPs、 (NH4)2SO4、 MgCl2、 KCl、 F‑IS6110、 R ‑IS6110、 F ‑MPB64、 R‑MPB64、 F‑rpoB、 R‑rpoB、 F‑gyrA、 R‑gyrA、 P‑IS6110、 P ‑MPB64、 P2 ‑rpoB、 P4‑rpoB、 P1‑gyrA、 P3‑gyrA、 P5‑gyrA。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述DNA聚合酶的工作浓度 为0.05‑0.2U/ μ L； 优选地， 所述dNTPs的浓度为0.15 ‑0.25mM； 优选地， 每种特异性引物的浓度各自独立 地选自0.02 ‑0.5 μmol/L； 优选地， 每种特异性探针的浓度各自独立 地选自0.02 ‑0.5 μmol/L； 优选地， 所述(NH4)2SO4的浓度为5 ‑15mM， 所述MgCl2的浓度为2 ‑5mM， 所述KCl的浓度为5 ‑ 15mM， 所述Tris ‑HCl的浓度为10 ‑30mM； 所述Tris ‑HCl的pH为8 ‑8.5。 8.如权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括阴性质控 品和阳性质控 品； 优选地， 所述试剂盒还 包括DNA提取 液， 所述DNA提取 液用于从待测样本中提取DNA。 9.一种结核分支杆菌复合菌群的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)从待测样本中提取DNA； (2)以步骤(1)提取得到的DNA作为模板， 利用权利要求1 ‑4任一项所述的多重引物或权 利要求6‑8任一项所述的试剂盒进行PCR扩增 和熔解曲线检测； 优选地， 所述PCR扩增包括以下两个反应 体系： dNTPs、 (NH4)2SO4、 MgCl2、 KCl、 Tris ‑HCl、 F‑IS6110、 R ‑IS6110、 F ‑MPB64、 R‑MPB64、 F‑ rpoB、 R‑rpoB、 F‑katG、 R‑katG、 F‑inhA、 R‑inhA、 F‑gyrA、 R‑gyrA、