(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210204979.9 (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 湖南杂交水稻研究中心 地址 410125 湖南省长 沙市芙蓉区马坡岭 远大二路73 6号 申请人 湖南农业大 学 (72)发明人 陈劲　袁定阳　刘志　余东　 孙志忠　谭炎宁　彭锐　王伟平　 (74)专利代理 机构 湖南兆弘专利事务所(普通 合伙) 43008 专利代理师 陈晖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6818(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测水稻植株镉离 子的试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测水稻植株镉离子的 试剂盒及检测方法， 试剂盒包括Enzyme  strand 和Substrate  strand。 检测方法为： 将Enzyme   strand和Sub strate strand进行预杂交获得预 杂交液； 将待检测的水稻组织与到预杂交液混 合， 通过检测荧光信号的强度检测镉的含量。 本 发明以镉离子为分子生物标志物， 通过基于Cd2+ 依赖性DNAzyme酶促反应和荧光共振能量转移 (FRET)机制， 建立Cd2+检测生物传感器， 实现对 水稻植株中Cd2+的快速检测。 该方法具有灵敏度 高、 稳定性好及成本低等独特优势， 对镉低积累 水稻品种的快速鉴定与选 育具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 114574616 A 2022.06.03 CN 114574616 A 1.一种检测水稻植株镉离子的试剂盒， 其特征在于， 包括： Enzyme  strand和Substrate   strand； 所述Enzyme  strand的DNA序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述Subst rate strand的DNA序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述Enzyme  strand的3 ’端修饰有荧光 淬灭基团； 所述Subst rate strand的5’端修饰有荧 光基团。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光淬灭基团为BHQ2， 所述荧光基 团为ROX。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括MES缓冲液。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述MES缓冲液包括20～150mM  MES、 10 ～100mM NaCl， pH＝ 4.5～6.5 。 6.一种水稻植株中镉离 子的检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法为： S1、 将权利要求1至5中任一项所述试剂盒中Enzyme  strand和Sub strate strand进行 预杂交获得 预杂交液； S2、 将待检测的水稻组织与到预杂交液混合， 通过检测荧 光信号的强度检测镉的含量。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特 征在于， 所述S1具体为： S1‑1、 将Enzyme  strand和Substrate  strand干粉分别用MES缓冲液稀释至 10～500nM， 按1:1～10:1体积比进行充分 混合得到混合液； S1‑2、 将所述混合液在90℃～97℃水浴锅中保温5～15min， 自然冷却过夜， 形成互补双 链结构。 8.根据权利要求6或7 所述的检测方法， 其特 征在于， 所述S2具体为： S2‑A1、 取水稻幼苗第一片完全展开叶的叶片浸 入预杂交液中； S2‑A2、 进行抽真空 处理， 在‑50kPa～10 0kPa时开始计时并维持5～3 0min， 静置过夜； S2‑A3、 将叶片置 于植物活体分子影 像系统中观察叶片荧 光光谱。 9.根据权利要求6或7 所述的检测方法， 其特 征在于， 所述S2具体为： S2‑B1、 剪取水稻幼苗 根上部分， 收集断口处流出的伤流液； S2‑B2、 将所述水稻伤流液与所述预杂交液混合得到混合液； S2‑B3、 将所述混合液置 于植物活体分子影 像系统中观察 荧光光谱。 10.根据权利要求6或7 所述的检测方法， 其特 征在于， 所述S2具体为： S2‑C1、 取水稻种子浸 入预杂交液中， 黑暗环境静止过夜； S2‑C2、 将种子 置于植物活体分子影 像系统中观察 荧光光谱。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574616 A 2检测水稻植株镉离 子的试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 植物保护技术领域， 尤其涉及 一种检测水稻植株镉离子的试剂盒及检 测方法。 背景技术 [0002]镉被广泛应用于电镀、 采矿、 冶炼、 电池等工业领域， 导致我国农田广泛的受到镉 污染。 镉可通过食物链进入 人体， 在人体内有长达10 ‑30年的生物半衰期 。 过量的镉积累， 会 导致包括肾损伤、 骨质疏松 甚至癌症的发生。 因此， 镉被国际癌症研究机构归类为第一致癌 物， 各国均制定 了一些强制性标准， 用于限定食品中的镉含量。 [0003]水稻就是一种易于富集镉的农作物。 近年来， 湖南的镉大米事件， 引起了广泛关 注。 目前， 生产上主要从现有的水稻品种中筛选镉低 积累的应急品种， 但这仅可部 分解决稻 米镉污染问题， 生产在迫切需要适宜在重度镉污染地区种植的镉低积累水稻品种。 因此， 筛 选和培育能在不同镉污染程度地区种植的镉低积累水稻品种成为 一种迫切。 [0004]按GB/T5009.15规定， 目前已有的镉含量检测方法主要有： 原子 吸收光谱法、 原子 荧光法、 比色法和高效液相色谱等方法。 然而， 上述方法均不同程度地存在实验周期长、 成 本高、 检测步骤繁琐等弊端， 难以大规模推广使用。 需要寻求一种以镉离子为分子生物标志 物， 通过基于Cd2+依赖性DNAzyme酶促反应和荧光共振能量转移(FRET)机制， 建立Cd2+检测 生物传感器， 实现对水稻植株中Cd2+的快速检测的方法。 发明内容 [0005]本发明针对上述需要解决的技术问题， 提供了一种检测水稻植株镉离子的试剂盒 及其检测方法， 是以镉离子为分子生物标志物， 通过基于Cd2+依赖性DNAzyme酶促反应和荧 光共振能量转移(FRET)机制， 建立Cd2+检测生物传感器， 实现对水稻植株中Cd2+的快速检 测。 该方法具有灵敏度高、 稳定性好及成本低等独特优势， 整个检测过程周期短、 反应迅速， 无需专业训练即可掌握操作流程， 便于快速推广使用， 对镉低积累 水稻品种的快速鉴定与 选育具有重要意 义。 [0006]为了实现上述目的， 本发明提供了一种检测水稻植株镉离子的试剂盒， 包括： Enzyme strand和Subst rate strand； [0007]所述Enzyme  strand的DNA序列如SEQ  ID NO.1所示； [0008]所述Subst rate strand的DNA序列如SEQ  ID NO.2所示。 [0009]上述的试剂盒， 进一步的， 所述Enzyme  strand的3 ’端修饰有荧光淬灭基团； 所述 Substrate strand的5’端修饰有荧 光基团。 [0010]上述的试剂盒， 进一 步的， 所述 荧光淬灭基团为BHQ2， 所述 荧光基团为ROX。 [0011]上述的试剂盒， 进一步 的， 所述试剂盒还包括MES缓冲液。 进一步 的， 所述MES缓冲 液包括20～150mM  MES、 10～100mM  NaCl， pH＝4.5～6.5。 进一步的， 所述MES缓冲液包括 50mM MES、 25mM NaCl， pH＝6.0 。说　明　书 1/6 页 3 CN 114574616 A 3