(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210199931.3 (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 中国热带农业科 学院椰子 研究所 地址 571339 海南省文昌市文清大道496号 (72)发明人 杨耀东　李静　吴翼　王永　肖勇　 刘蕊　张璐璐　曾春茹　 (74)专利代理 机构 深圳市千纳专利代理有限公 司 44218 专利代理师 张新蕊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 用于鉴别马哇椰子的I nDel标记及其应用 (57)摘要 本发明提供了用于鉴别 马哇椰子的InDel标 记及其应用， 其中， InDel标记的引物对如SEQ  ID  No.1‑2所示、 如SEQ  ID No.3‑4所示或如SEQ  ID  No.5‑6所示， 由上述引物对中的两种或两种以上 可以组成InDel标记引物组， InDel标记引物对或 InDel标记引物组可以制 成试剂盒。 采用本发明 的InDel标记引物对或InDel标记引物组或试剂 盒对不同品种椰子进行PCR扩增电泳， 即可根据 电泳条带鉴别出马哇椰子品种， 可以在苗期到成 年大树中随时检测， 鉴定准确率高， 对于区分马 哇椰子具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114438253 A 2022.05.06 CN 114438253 A 1.用于鉴别马哇椰子 的InDel标记， 其特征在于， 所述InDel标记的引物对为如SEQ  ID  No.1‑2所述引物对、 如SEQ  ID No.3‑4所述引物对、 或者如SEQ  ID No.5‑6所述引物对。 2.一种用于鉴别马哇椰子的InDel标记引物组， 其特征在于， 所述InDel标记引物组由 以下引物对 中的两种或两种以上组成： 如SEQ  ID No.1‑2所述引物对、 如SEQ  ID No.3‑4所 述引物对、 如SEQ  ID No.5‑6所述引物对。 3.一种用于鉴别马 哇椰子的试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1所述的InDel标记 引物对、 或者权利要求2所述的I nDel标记引物组。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 其还包括进行PCR反应和/或电泳所需的 试剂。 5.权利要求1所述的InDel标记的引物对或者权利要求2所述的InDel标记引物组或者 权利要求3或4所述的试剂盒在鉴别马哇椰子中的应用。 6.一种鉴别马哇椰子的方法， 其特征在于， 采用权利要求1述的InDel标记的引物对或 者权利要求2所述的I nDel标记引物组或者权利要求3或4所述的试剂盒进行。 7.根据权利要求6所述的方法， 包括以下步骤： (1)提取各品种椰子叶片 DNA； (2)采用I nDel标记引物对或I nDel标记引物组或试剂盒对椰子叶片 DNA进行PCR扩增； (3)对扩增结果进行凝胶电泳检测； (4)根据检测结果对不同品种椰子进行鉴别， 凝胶电泳结果显示两条带的为马哇椰子， 一条带的为其他品种椰子 。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 凝胶电泳结果有两条电泳条 带的， 且 存在电泳结果大于或小于目的条带的是马哇椰子， 而电泳结果显示只有一条条带的或 与目的条带目的片段大小一致的是其他品种椰子， 其中： 当所述InDel标记引物对为如SEQ   IDNo.1‑2所示引物对时， 目的条带或目的片段为109bp； 当所述InDel标记引物对为如SEQ   IDNo.3‑4所示引物对时， 目的条带或目的片段为140bp； 当所述InDel标记引物对为如SEQ   IDNo.5‑6所示引物对时， 目的条 带或目的片段为141bp。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取马哇椰子叶片 DNA； (2)采用InDel标记引物对或InDel标记引物组或试剂盒对马哇椰子叶片DNA进行PCR扩 增； (3)对PCR产物进行 聚丙烯酰胺胶电泳检测， 并用胶回收试剂盒对电泳结果中两条电泳 条带分别进行回收； (4)回收产物进行PCR扩增后将PCR产物进行 纯化， 连接转 化后挑单 克隆测序； (5)根据测序结果以高种 椰子基因组为参照对马哇椰子测序序列进行Blast比对， 存在 插入片段的是马哇椰子 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438253 A 2用于鉴别马哇椰子的InDel标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学及生物信息学领域， 具体涉及用于鉴别马哇椰子的InDel 标记及其应用。 背景技术 [0002]椰子(Cocos  nucifera  L.)是棕榈科椰子属中唯一的一个种， 属于单子叶多年生 常绿乔木， 其浑身是宝， 被誉为 “生命之树 ”是热带地区重要的木本油料作物和食品能源作 物， 经济寿命达40 ‑80年， 自然 寿命可达10 0年以上。 [0003]按照常规分类方法可将椰子分为高种椰子、 矮种椰子以及介于高种和矮种之间的 中间类型。 其中高种椰子的主要特征为植株高大， 椰干基部膨大呈 “葫芦头”， 异花授粉； 而 矮种椰子植株矮小， 椰干基部没有 “葫芦头”， 自花授粉， 经济寿命和自然寿命较短； 中间类 型则介于以上两者之间。 此外， 在各类变种中根据果实大小、 果实形状和果皮颜色等， 又将 椰子种质资源分为若干类型， 例如矮种椰子可根据果皮颜色分为黄矮、 红矮、 褐矮和绿矮 等。 [0004]马哇椰子是法国油料油脂研究所(IRHO)在科特迪瓦试验站用马黄矮和西非高种 杂交而成。 马哇于1979年首次引进海南岛， 经多年布点试种观察， 结果表明： ①马哇种比海 南高种(对照)生长快， 投产早， 产量高。 ②马哇种的生育习性和果实主要营养(椰干、 脂肪、 蛋白质等)含量以及抗病、 虫能力与海南高种无显著差异。 ③马哇种的不良性状有： 果实偏 小， 叶痕距大， 树干拔高太快， 底层老叶衰落过早， 同时， 叶软而脆， 抗风能力较次。 尽管马哇 种抗风、 寒(幼龄期)能力比海南高种略次， 但即使是在海南岛北部重风害和低 温区之一的 文昌县种植， 仍能获得高产， 其产量仍比海南高种高50％， 甚至1倍 以上， 因此经济效益较 高， 马哇椰子可在海南岛已有的高种椰 区种植， 而在东南沿海的万宁、 陵水、 三亚和乐东一 带种植更能表现其高产特性。 [0005]InDel标记(Insertion ‑Deletion)是在全基因组重测序的基础上开发的， 是等位 基因位点上DNA插入或缺失一段短序列产生的多态性变异。 简单来说就是两个亲本在全基 因组中的差异， 对于其中的一个亲本基因组， 另外一个亲本中有一定数量的核苷酸的插入 或者缺失， 可以根据基因组中插入或缺 失的位点， 设计扩增这些位点的PCR引物， 就是InDel 标记。 [0006]InDels广泛分布在整个基因组中， 与其它的分子标记相比， 在基因组的相同位置 出现相同大小的InDel标记的几率很小， 避免了后续分析的模糊性。 在基因组序列测定的基 础上， InDel标记可以通过生物信息学的方法方便简单地获得。 与SSR标记相比， InDel标记 的扩增产物带型清晰简单， 稳定性和产物分离效果均优于SSR标记。 InDel标记具有其它分 子标记的优点。 基于全基因组重测序的InDel标记， 具有在基因组内分布广、 密度高、 多态 性 强、 检测容易、 分型系统简单、 遗传稳定。 InDel标记适用于全基因组分子标记的开发， 目前 已开始应用于动植物群体遗传分析、 构建高密度分子标记遗传图谱和基因定位、 生物的遗 传多样性分析、 分子 辅助育种以及人类法医遗传学、 医学诊断等领域。说　明　书 1/5 页 3 CN 114438253 A 3