(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210198789.0 (22)申请日 2022.03.02 (71)申请人 苏州大学附属第一医院 地址 215006 江苏省苏州市十 梓街188号 (72)发明人 丁子轩　陈苏宁　沈宏杰　解珺丹　 姚红　马亮　邱桥成　江艾蕊　 王曼　 (74)专利代理 机构 南通毅帆知识产权代理事务 所(普通合伙) 32386 代理人 孙烨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变 的巢式PCR引物和方法 (57)摘要 本发明属于病毒基因组学和药物基因组学 领域， 具体 涉及一种检测巨细胞病毒U L54和UL97 基因耐药突变的巢式PCR引物和方法。 首先公开 了一种用于巢式PCR方法检测巨细胞病毒的引物 组， 包括长引物组、 短引物组和通用测序引物组； 所述长引物组的核苷酸序列选自以下任意一组： SEQ ID NO:1‑2或SEQ ID NO:3‑4； 所述短引物组 的核苷酸序列选自以下任 意一组： SEQ  ID NO:5‑ 6、 SEQ ID NO:7‑8、 SEQ ID NO:9‑10、 SEQ ID NO: 11‑12、 SEQ ID NO:13‑14、 SEQ ID NO:15‑16、 SEQ  ID NO:17‑18、 SEQ ID NO:19‑20、 SEQ ID NO:21‑ 22、 SEQ ID NO:23‑24、 SEQ ID NO:25‑26、 SEQ ID  NO:27‑28、 SEQ ID NO:29‑30、 SEQ ID NO:31‑32 或SEQ ID NO:33‑34； 所述通用测序引物组的核 苷酸序列如SEQ  ID NO:35和SEQ  ID NO:36所示。 本发明公开了一种快速、 准确的测定UL54、 UL97 全部编码序列的方法， 该方法可用于分析耐药突变的类型， 为临床治 疗提供指导。 权利要求书1页 说明书12页 序列表6页 附图4页 CN 114410846 A 2022.04.29 CN 114410846 A 1.一种用于巢式PCR方法检测巨细胞病毒的引物组， 其特征在于， 包括长引物组、 短引 物组和通用测序引物组； 所述长引物组的核苷酸序列选自以下任意 一组： SEQ ID NO:1‑2或SEQ ID NO:3‑4； 所述短引物组的核苷酸序列选 自以下任意一组： SEQ  ID NO:5‑6、 SEQ ID NO:7‑8、 SEQ  ID NO:9‑10、 SEQ ID NO:11‑12、 SEQ ID NO:13‑14、 SEQ ID NO:15‑16、 SEQ ID NO:17‑18、 SEQ ID NO:19‑20、 SEQ ID NO:21‑22、 SEQ ID NO:23‑24、 SEQ ID NO:25‑26、 SEQ ID NO:27‑ 28、 SEQ ID NO:29‑30、 SEQ ID NO:31‑32或SEQ ID NO:33‑34； 所述通用测序引物组的核苷酸序列如SEQ  ID NO:35和SEQ ID NO:36所示。 2.一种检测巨细胞病毒的方法， 其特征在于， 采用巢式PCR方法， 所述巢式PCR方法中利 用如权利要求1所述的引物组。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特 征在于， 所述方法包括： S1： 获得DNA样品； S2： 进行第一轮PCR； S3： 进行第二轮PCR； S4： 第二轮PCR产物消化后进行测序反应。 4.根据权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 在S2中  ， 将CMV反应混合液A、 引物组和Taq 酶混合后置 于PCR仪中， 运行程序进行第一轮PCR。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 在S2和S3中， PCR程序为： （1） 95℃， 4 ‑6分 钟； （2） 95℃， 20‑40秒； （3） 55 ‑57℃， 20‑40秒； （4） 72℃， 1 ‑2分钟； （5） 重复步骤 （2） ‑（4） 20‑30 次； （6） 72℃， 2 ‑4分钟； （7） 维持4℃。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 在S2和 S3中， 将CMV反应混合液A、 引物组和 Taq酶混合后置 于PCR仪中， 运行程序进行第一轮PCR和第二轮PCR。 7.根据权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 在S4中， 在第二轮PCR产物中加入虾碱酶进 行消化。 8.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 在S4中， 使用通用测序引物组进行测序反 应。 9.根据权利要求1所述的用于巢式PCR方法检测巨细胞病毒的引物 组或权利要求2 ‑8任 一项所述的方法在病毒和/或药物领域中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410846 A 2检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药 突变的巢式PCR引物和 方法 技术领域 [0001]本发明涉及病毒基因组学和药物基因组学领域， 具体涉及一种检测巨细胞病毒 UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物和方法。 背景技术 [0002]人巨细胞病毒(human  cytomegalovirus， HCMV)属于疱疹病毒B亚科的线状双链 DNA病毒。 HCMV感染在人群中普遍存在， 多呈隐性或潜伏感染。 但新生儿宫内感染或围产期 感染， 可导致先天畸形、 智力低下和发育迟缓以及听力和视力障碍等。 器官移 植、 骨髓移 植、 艾滋病等免疫抑制个体和免疫缺陷者感染后则可引起肺炎、 胃肠道 不适、 视网膜炎、 肝炎等 严重的甚至危及生命的疾病。 目前， 诊断和评估HCMV载量的检测手段是qPCR。 抗HCMV的药物 主要有： 更昔洛韦(ganciclovir， GCV)、 膦甲酸钠(fascarnet， FOS)和西 多福韦(cidofovir， CDV)。 但是， 耐药株的出现给治疗 带来了很大困难， 而qPCR只能通过检测病毒 载量的升高推 测出发生耐药。 如果能明确的鉴定耐药株并识别出耐药类型， 将大大提高治疗的有效性和 经济性。 [0003]目前的研究发现对更昔洛韦的耐药主要是由编码病毒磷酸转移酶的UL97基因突 变引起的； 而编码病毒DNA聚合酶的UL54基因突变， 除了也可能导致对更昔洛韦的耐药外， 还可以导致对膦甲酸钠和/或西多福韦的耐药。 因此一种快速、 准确的测定UL54、 UL97全部 编码序列的方法， 将可用于分析耐药突变的类型， 为临床治疗提供指导。 [0004]然而现有的检测巨细胞病毒基 因耐药突变的方法存在各种局限性， 例如经典的空 斑减少实验， 需要对分离自患者的病毒进行培养， 费时(需要4 ‑6周)费力， 也不适用于大规 模检测。 [0005]巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变位点众多， 传统的基因突变诊断方法(例如 限制性长度多态 性分析、 基因芯片、 荧光定量P CR)需要针对已知的突变类型进 行设计， 无法 覆盖全部位 点。 [0006]CN106636462A采用测序的方法覆盖了多数耐药位点， 但存在以下问题： (1)UL54、 UL97基因的完整编码区分别为3 729bp(NC_006273.2:78194 ‑81922)、 2124bp(NC_006273.2: 141798‑143921)， 此专利中记载的方法并未覆盖UL54、 UL97基因全部编码区(2270bp、 1066bp)， 可能遗漏导致耐药的其他突变； (2)第二轮扩增产物较大， 扩增效率势必降低， 对 于病毒载量较低的标本可能无法产生 足量的扩增产物， 且 之后的测序信号质量势必不及较 短的产物； (3)引物设计时并未考虑UL54和 UL97基因序列上众多的多态性位点， 可能在PCR 扩增阶段导 致扩增偏倚， 低估甚至 遗漏部分耐药株。 [0007]CN111334612A方法也选择了测序的方法， 但存在以下问题： (1)未包含对UL54基因 的检测， 后者的突变除了可以导致对更昔洛韦的耐药外， 还可以导致对膦甲酸钠和/或西多 福韦的耐药； (2)目标区域(761bp)未包含对UL97基因全部编码区的检测， 可能遗漏导致耐 药的其他突变； (3)对UL97基因的扩增产物直接用于测序， 由于扩增产物较长(670bp、说　明　书 1/12 页 3 CN 114410846 A 3