(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210206080.0 (22)申请日 2022.03.03 (71)申请人 云南农业大 学 地址 650000 云南省昆明市盘龙区沣源路 452号 (72)发明人 杨艳梅　胡先奇　刘沛　彭焕　 余兴华　杜霞　姚汉央　李云霞　 邓春菊　李艳　 (74)专利代理 机构 昆明正原 专利商标代理有限 公司 53100 专利代理师 程相桂　陈左 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测葡萄根结线 虫的特异 性引物、 试剂盒及 检测方法 (57)摘要 本 发 明 涉 及一 种检 测葡 萄 根 结 线 虫 （Meloidogyne  vitis） 的特异性引物、 试剂盒及 检测方法， 本发明以葡萄 根结线虫rDNA ‑ITS序列 为靶标， 设计筛选出特异性强、 检测 效率高的葡 萄根结线虫的特异性引物， 在此基础上， 本发明 提供了检测葡萄根结线虫的试剂盒及检测方法， 所提供的检测方法及试剂盒具有操作简单、 检测 效率高、 特异性强等优点， 检测灵敏度可达直接 检测单头雄虫、 单头2龄幼虫及10‑4头雌虫DNA， 且能实现混合线虫种群中葡萄根结线虫的检测 及土壤样品中葡萄根结线虫的检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图4页 CN 114592069 A 2022.06.07 CN 114592069 A 1.一种检测葡萄根结线虫 （ Meloidogyne vitis ） 的特异性引物， 其特征在于： 包括正向 引物和反向引物， 其引物序列分别为 正向引物 （Mv ‑F） ： （5，‑ ctggttcagggtcatttataaac‑3，） ， （SEQ ID NO.1） ； 反向引物 （Mv ‑R） ： （5，‑ tatacgct tgtgtggatgac ‑3，） ， （SEQ ID NO.2） 。 2.一种葡萄根结线虫的检测方法， 其特征在于， 包括： （1） 提取葡萄根结线虫DNA； （2） 以 提取的DNA为模板， 利用如权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增； （3） 以水为模板作为 阴性对照， 以扩增产物进行 结果判断。 3.根据权利 要求2所述的葡萄根结线虫的检测方法， 其特征在于， 步骤 （2） 的PCR扩增反 应程序为， 94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性30 s， 53 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min， 35个循 环； 72 ℃后延伸10 mi n。 4.根据权利要求2或3所述的葡萄根结线虫的检测方法， 其特征在于， 步骤 （2） 所述的 PCR扩增反应体系以25 µL计包括以下组分： 10 ×PCR Buffer 2.5 µL、 dNTPs 2 µL、 10 µ mol/L正、 反向引物各1 µL、 DNA模板2.5 µL、 5 U/µL Taq 酶0.25 µL， ddH2O 补足至25 µL。 5.根据权利 要求2所述的葡萄根结线虫的检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 取5 µL扩 增产物用2 %琼脂糖凝胶电泳检测并于 凝胶成像仪中拍照。 6.如权利要求1所述的特异性引物在检测葡萄根结线虫中的应用。 7.含有如权利要求1所述引物的试剂盒。 8.根据权利要求7所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒在检测 葡萄根结线虫中的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592069 A 2检测葡萄根结线虫的特异性引物、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 检测根结线虫的引物， 尤其涉及一种检测葡萄根结线虫 （ Meloidogyne   vitis） 的特异性引物、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]根结线虫 （ Meloidogyne  spp.） 是一类种类多、 寄主范围广、 发生为害面积大、 经济 损失严重的高度专化性的杂食性植物病原物， 其种类繁多， 目前国际上报道的根结线虫种 类已超过100种。 作物受根结线虫为害后， 一般造成减产10%~20%， 重者达75%以上。 葡萄 （Vitis vinifera  L.） 是我国一种 重要的水果作物， 具有重要经济价值。 然而， 包括植物寄 生线虫在内的各种病原严重威胁着葡萄的生长， 根结线虫是制约葡萄生产 的重要因素之 一。 目前发现为害葡萄的根结线虫主要有南方根结线虫 （ Meloidogyne  incognita ） 、 爪哇根 结线虫 （M. javanica） 、 花生根结线虫 （ M. arenaria ） 及北方根结线虫 （ M. hapla） 4种常见 种类， 此外， 埃塞俄比亚根结线虫 （ M. ethiopica ） 、 娜塔莉根结线虫 （ M. nataliei ） 和泰晤 士根结线虫 （ M. thamesi） 也被报道为害葡萄生产。 [0003]以会阴花纹为核心的形态学鉴定方法是早期根结线虫种类鉴定的主要方法。 然 而， 由于根结线虫种内形态变异及种间相似性的存在， 依赖于会阴花纹的形态学鉴定方法 可能面临巨大挑战。 同工酶电泳技术因其表型稳定， 不易受环境条件影响， 虽是根结线虫种 类鉴定的重要方法， 然而， 该技术不能实现对2龄幼虫的检测， 从而限制了该技术用于2龄幼 虫的常规检测和诊断。 分子生物学鉴定技术可以克服以上方法的不 足而逐渐成为根结线 虫 种类鉴定的重要手段。 葡萄根结线虫是发明人所在课题组发现高密度寄生于葡萄的根结线 虫新种 （新种ITS区序列： MN816222.1） ， 该线虫在侵染地高密度存在， 对葡萄造成严重损害， 其具有极强的适应能力、 繁殖能力和传播能力， 对葡萄造成严重损害， 研制一种快速、 可靠、 灵敏的检测方法对于葡萄根结线虫 预防、 检疫和防治具有重要的意 义。 发明内容 [0004]基于DNA的分子生物学鉴定方法已在大量根结线虫种类鉴定中得到广泛应用。 根 结线虫核糖体DNA的内转录间隔区(ribosomal  DNA‑internal  transcribed  spacer,  rDNA‑ITS)是根结线虫鉴定中最常用的检测标记之一。 [0005]本发明根据葡萄根结线虫rD NA‑ITS序列为靶标， 设计筛选出葡萄根结线虫的特异 性引物， 并进一步对该引物的可靠性、 特异性、 灵敏性进行检测， 建立了葡萄根结线虫特异 性检测方法， 该方法检测灵敏度高， 特异性强， 可用于单头 雄虫、 单头2龄幼虫、 10‑4头雌虫和 混合线虫群 体中葡萄根结线虫的检测， 也能实现土壤中葡萄根结线虫的检测。 [0006]为此， 本发明的目的在于提供一种检测葡萄根结线虫的特异性引 物、 利用该引 物 检测葡萄根结线虫的方法以及含有该引物的试剂盒。 [0007]本发明的上述目的是通过以下技 术方案实现的。 [0008]所述检测葡萄根结线虫的特异性引 物， 包括正向引 物和反向引物， 其引物序列分说　明　书 1/7 页 3 CN 114592069 A 3