(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221020813 0.9 (22)申请日 2022.03.03 (71)申请人 广东省人民医院 地址 510080 广东省广州市越秀区中山 二 路106号广东省人民医院主体楼 24楼 (72)发明人 顾兵　胡雪姣　邓倩昀　王子霞　 李广华　李正康　龚彩平　刘长鈺　 赵云虎　张鑫强　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 嗜肺军团菌和登革热核酸定量联合检测试 剂 (57)摘要 本发明涉及病原检测技术领域， 尤其涉及嗜 肺军团菌和登革热核酸定量联合检测试剂。 本发 明提供了登革热和嗜肺军团菌的ddPCR检测引物 和探针， 所述引物和探针特异性高； 灵敏度强， 能 够检测低至20copies/mL， 避免了荧光定量可能 出现的假阴性； 同时进行4个检测通道和一个内 控通道， 减少了加样可能造成的污染； 同时检测 多种病原 体， 减少工作量， 提高检测效率； 液滴中 实现绝对定量， 无需标准曲线。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图3页 CN 114410847 A 2022.04.29 CN 114410847 A 1.引物探针组合， 其特 征在于， 包括： 登革热病毒检测引物、 探针： 上游引物的核酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 下游引物的核酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 探针的核酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 嗜肺军团菌检测引物、 探针： 上游引物的核酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 下游引物的核酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 探针的核酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特 征在于， 如SEQ ID NO:3所示核酸序列的探针5 ’端修饰FAM基团， 3 ’端修饰MGB基团； 如SEQ ID NO:6所示核酸序列的探针5 ’端修饰VIC基团， 3 ’端修饰MGB基团。 3.登革热和嗜肺军团菌的联检试剂， 其特征在于， 包括权利要求1或2所述的引物探针 组合。 4.根据权利要求3所述的联检试剂， 其特 征在于， 还 包括ddPCR反应试剂。 5.根据权利要求3所述的联检试剂， 其特征在于， 还包括内参基因检测引物探针； 所述 内参基因为SM YD3， 其探针以A425标记。 6.非诊断目的检测登革热和嗜肺军团菌的方法， 其特征在于， 以权利要求3～5任一项 所述的联检试剂对样品进行检测。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述检测的体系包括： 登革热病毒检测上 下游引物各0.15 μL、 登革热病毒检测探针0.0375 μL、 嗜肺军团菌检测上下游引物各0.15 μL、 嗜肺军团菌检测探针0.0 375 μL、 ddPCR反应试剂3 μL、 待测样品3～7 μL、 水补足 15 μL。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述检测的扩增程序包括： 95℃5min， (95 ℃15s， 56℃～62℃3 0s)40个循环。 9.根据权利要求6～8任一项所述的方法， 其特征在于， 所述样品包括来自环境的样品， 包括水样、 土壤样品或物体表面拭子 。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特 征在于， 所述样品在检测前提取cf  DNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410847 A 2嗜肺军团菌和登革热核酸定量联合检测试剂 技术领域 [0001]本发明涉及病原检测技术领域， 尤其涉及嗜肺军团菌和登革热核酸定量联合检测 试剂。 背景技术 [0002]亚热带地区气候潮湿、 水系众多， 蚊虫滋生， 因此虫媒传染病高发， 以登革热最为 流行； 另一方面空调的普及和常年使用， 空调冷凝水也成为疾病传播的重要因素之一， 嗜肺 军团菌尤为常见。 [0003](1)登革热病毒 [0004]登革热是全球仅次于疟疾流行最广泛的、 危害最严重 的虫媒传染病， 是导致前往 热带和亚热带地区的旅行者 发热的主要致病原因之一。 除了撒哈拉以南的非洲地区没有登 革热流行之外， 全球六大世界卫生组织区域均存在输入性登革热传播或地方性登革热流 行， 而全球化 发展则是促进输入性登革热在世界范围内广泛传播的重要因素。 目前， 全球超 过50％以上的人口面临输入性登革热感染威胁， 约5 0％的人居住在登革热地方性 流行区。 [0005]传播登革热的最主要媒介是埃及伊蚊 (A .aegypti) ， 其次白纹伊蚊 (A.albopictus)。 感染过登革热病毒的伊蚊， 可以经卵将病毒传给下一代； 且 经卵传递获得 登革热病毒的子代 雄蚊， 可以继续通过交配传递给雌蚊。 凡有伊蚊活动的地区， 遇到 登革热 患者叮咬吸血后都可能在人群中传播登革热， 产生 二代感染流行。 [0006]登革热病毒(DENV)类型有四种， 分别为 Ⅰ型、Ⅱ型、 III型和 Ⅳ型， 感染任何一型都 会产生对该型病毒终身特异 性免疫， 任何一型病毒都能引起登革热暴发流行和重症病例发 生感染登革热的临床症状复杂， 常易与其他 发热性疾病混淆。 典型病例患者经过潜伏期， 突 起发热， 持续2 ‑7天， 伴肌肉酸痛、 关节痛、 厌食、 咽喉痛、 头痛和皮肤斑疹出血等。 二次感染 登革热(因抗体依赖增强症效应)或感染致命性病毒株是危及生命的两大 因素。 严重病例出 现的血小板减少症和血 管通透性增 加能导致出血和休克等并发症。 [0007]快速病例检验确诊， 及时临床治疗， 包括静脉补液等， 可将重症患者死亡率降到 1％以下。 目前为止， 登革热既没有疫苗预防， 也没有 特异性抗病毒 药物治疗， 实际预防登革 热流行还在于防蚊灭蚊， 然而实践表明防控效果有限。 只有尽早快速准确地诊断疾病， 才能 对急性期患者进行早报告、 早隔离、 早就地治疗， 并且及时开展蚊媒的灭杀工作， 才有利于 登革热疫情的控制。 [0008]登革病毒的快速检测主要包括抗体检测、 抗原检测、 核酸检测、 病毒分离。 因为在 标本采集过程中， 血液的采集和处理最方便， 对患者造成的创伤和损害最小， 几乎在 整个感 染期间血液都能用于检测， 因此登革热检测中采集的病例标本普遍以血液为主。 但是登革 病毒抗体与其他黄病毒抗体存在交叉反应， 加之我国将乙型脑炎预防接种作为计划免疫的 一部分， 因此在检测过程中需要注意非特异性反应， 同时结合患者临床症状和流行病 学史 对抗体阳性结果加以区分。 抗原检测是对对病毒蛋白的检测， 目前主要是针对非结构 蛋白 NS1检测， NS1产生于感染早期甚至早于IgM的出现， 适用于早期诊断， 但是在抗NS1 ‑IgG出现说　明　书 1/9 页 3 CN 114410847 A 3