(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210200367.2 (22)申请日 2022.03.03 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114317727 A (43)申请公布日 2022.04.12 (73)专利权人 上海恩元生物科技有限公司 地址 201315 上海市浦东 新区秀浦路25 55 号1幢11楼 专利权人 江苏恩华药业股份有限公司 (72)发明人 孙家权　任斌　魏小元　张玉祥　 陈瑞旭　王中　 (74)专利代理 机构 上海百一领御专利代理事务 所(普通合伙) 31243 专利代理师 王奎宇(51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 104673891 A,2015.0 6.03 审查员 宋如生 (54)发明名称 用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量检测试 剂及应用 (57)摘要 本发明提供了一种用于SMN1/SMN2 基因拷贝 数变异和SMN1常见热点突变位点的检测试剂、 试 剂盒及检测方法， 以解决现有单一技术仅能检测 拷贝数变异或仅能分析热点突变以及基因分型 检测技术中费时、 程序繁琐以及易污染等问题。 本试剂或试剂盒可以快速、 准确、 便宜、 高通量地 实现区分SMA患者、 携带者及正常人的便利性和 有效性， 同时灵敏度高， 特异性强， 适用于常见样 本比如血液、 口腔拭子等。 本发明能够快速、 低 廉、 准确、 高通量地检测人体血液或者其他组织 细胞中SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热 点突变位点的型别， 对于分型技术而言， 是目前 性价比最好的方法， 便于临床或者健康检测大规 模的推行。 权利要求书1页 说明书26页 序列表3页 附图20页 CN 114317727 B 2022.07.15 CN 114317727 B 1.用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂， 其特征在于， 包括用于扩增SMN1/ SMN2基因外显子7的特异性引物1和引物2， 以及与扩增产物杂交的特异性探针1和探针2； 所 述引物1和引物2的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示； 所述引物1和引物2 的反应浓度均为500 ‑900nmol/L； 所述探针1和探针2的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.11和 SEQ ID NO.12所示； 所述探针1和探针2的反应浓度均为15 0‑250nmol/L； 和包括用于扩增 SMN1/SMN2基因外显子8的特异性引物3和引物4， 以及与扩增产物杂交 的特异性探针3和探针4； 所述引物3和引物4的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID  NO.4所示； 所述引物3和引物4的反应浓度均为500 ‑900nmol/L； 所述探针3和探针4的核苷酸 序列分别如SEQ  ID NO.13和SEQ  ID NO.14所示； 所述探针3的反应浓度为250 ‑350nmol/L； 所述探针4的反应浓度为10 0‑200nmol/L； 以及包括用于扩增SMN1基因热点突变c.22dupA位点的特异性引物5和引物6， 和用于扩 增SMN1基因热点突变c.683T>A位点的特异性引物7和引物8； 以及与c.22dupA扩增产物杂交 的特异性探针5和与c.683T>A扩增产物杂交的特异性探针6； 所述引物5、 引物6、 引物7、 引物 8的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.5、 SEQ  ID NO.6、 SEQ  ID NO.7和SEQ  ID NO.8所示； 所述 引物5、 引物6、 引物7和引物8的反应浓度均为200 ‑400nmol/L； 所述探针5和探针6的核苷酸 序列分别如SEQ  ID NO.15和SEQ  ID NO.16所示； 所述探针5和探针6的反应浓度均为50 ‑ 150nmol/L。 2.根据权利要求1所述的用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂， 其特征在于， 所述引物1和引物2的反应浓度均为700nmol/L； 所述探针1和探针2的反应浓度均为 200nmol/L； 所述引物3和引物4的反应浓度均为700nmol/L； 所述探针3的反应浓度为 300nmol/L； 所述探针4的反应浓度为150nmol/L； 所述引物5、 引物6、 引物7和引物8的反应浓 度均为300nmol/L； 所述探针5和探针6的反应浓度均为10 0nmol/L。 3.根据权利要求1或2所述的荧光定量检测试剂， 其特征在于， 还包括用于扩增内参基 因的特异性引物9和引物10， 以及与扩增产 物杂交的特异性探针7； 所述内参基因是GAPDH基 因， 所述引物9和引物10的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.9和SEQ  ID NO.10所示； 所述探针7 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.17所示。 4.根据权利要求3所述的荧光定量检测试剂， 其特征在于， 所述引物9和引物10的反应 浓度均为6 00nmol/L； 所述探针7的反应浓度为3 00nmol/L。 5.一种用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 包括权利要求1 ‑4任一项所述的检测试剂。 6.根据权利要求5所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括DNA聚合酶、 DNA 模板、 超纯 水。 7.权利要求1 ‑4中任一项所述的检测试剂 或权利要求5或6所述的检测试剂盒在制备用 于SMN基因拷贝数分析的产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317727 B 2用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量 检测试剂及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 尤其是涉及一种用于人运动神经元存活基因 （SMN基 因） 拷贝数分析的荧 光定量检测试剂、 检测试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]脊髓性肌萎缩症是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病， 以脊髓前角 α ‑运动神经 元退化变性导致近端肢体和躯干进 行性、 对称性肌无力和肌萎缩为主要临床特征。 95%以上 是由位于5号染色体长臂的SMN1缺失或突变所致的5q ‑SMA。 SMA发病率约为1/10000， 人群携 带率约为1/ 50。 [0003]脊髓性肌萎缩症国际协会根据SMA患者的发病年龄和临床表现将脊髓性肌萎缩症 分为4种类型： Ⅰ型 （婴儿型） 、 Ⅱ型 （中间型） 、 Ⅲ型 （青年型） 、 Ⅳ型 （成人型） 。 Ⅰ型患者， 发病年 龄小于6个月， 四肢及躯干严重的软弱无力， 大多 数患者在两岁前就会因呼吸衰竭或进食问 题而死亡。 Ⅱ型患者， 于出生6~18个月内发病， 可以独坐但多数不能站立或独走， 预期寿命 在20~40岁。Ⅲ型患者， 出生 18个月后才发病， 患者能够独立行走， 病情进展缓慢可生存至成 年， 寿命不缩短或轻微下降。 Ⅳ型患者， 发病年龄在成年后， 发病和进展隐匿， 生存寿命与正 常人无差异， 患者可 出现行走困难。 [0004]SMA的致病基因SMN1和修饰基因SMN2高度同源， SMN1决定疾病的发生， SMN2影响疾 病的严重程度和进展， 使 得SMA的遗传学诊断不同于绝大数单基因遗传病。 S MN1与SMN2之间 仅存在5个碱基差异， 分布在内含子6到外显子8上。 SMN1可以产生全长运动神经元蛋白， 其 同源基因SMN2由于外显子7上的突变 （c.840C>T） 导致SMN2基因产生可变剪接体， 使产生的 SMN蛋白不稳定或无功能， 只有约10%的SMN2可以翻译成全长SMN蛋白。 [0005]SMN1的突变包括7号和/或8号外显子缺失以及致病的热点突变位点等类型。 根据 SMN1基因拷贝数的检测， 可以实现对SMA患者、 携带者及正常人的诊断： 当检出SMN1基因纯 合缺失时为SMA患者， 当检出1个SMN1拷贝数时为SMA携带者， 当检出2个SMN1基因拷贝数时 为正常人。 根据SMN1基因热点突变位点的检测， 可评判是否携带致病变异。 根据SMN2基因拷 贝数的检测， 可以评估SMA病情的严重程度、 是否需要立即接受治疗等。 [0006]2019年我国  上市了疾病修正治疗药物诺西那生钠注射液， 也相继发表了脊髓性 肌萎缩症多学科管理及遗传学诊断专家共识， 标志着SMA在我国进入了一个全新的精准诊 治和管理时期。 目前， 我国一些地区逐渐开始筛查， SMA预防窗口进一 步提前。 [0007]可用于SMN1/SMN2基因拷贝数定量检测及SMN1基因变异位点检测的技术很多， 包 括如基因测序法、 限制性片段长度多态 性法 （RFLP法） 、 变性高效液相色谱法 （DHPLC 法） 以及 荷兰MRC公司推出仅用于科学研究的基于多重连接探针扩增法 （MLPA法） 的SMA检测试剂等。 其中， 基因测序法为基因分型的金标准， 该方法适合高通量多位点的检测， 该方法仅可对 SMN1基因外显子7、 外显子8纯合缺失 （即0拷贝） 的SMA病例进行检测， 无法对SMN1基因缺失 突变携带者进 行检测； 同时， 其费时， 操作复杂， 对操作人员要求高且灵敏度低， 容易出现样 本间交叉污染且不适合快速临床检测； 并且测序获得数据信息量较大， 很多信息对患者没说　明　书 1/26 页 3 CN 114317727 B 3