(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210204674.8 (22)申请日 2022.03.03 (71)申请人 杭州联川生物技 术股份有限公司 地址 310018 浙江省杭州市杭州经济技 术 开发区6号大街26 0号 (72)发明人 杨欢欢　 (74)专利代理 机构 杭州信与义专利代理有限公 司 33450 专利代理师 万景旺 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测结直肠癌多基因变异的引物、 探针、 试 剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测结直肠癌多基因变 异的引物、 探针、 试剂盒及其应用， 属于基因检测 技术领域。 其中， 所述多基因包括KRAS、 NRAS、 BRAF、 PIK3CA。 本发明的试剂盒检测样本类型丰 富， 所需样本量少， 含有内控系统， 能更加准确、 稳定地对样本进行检测， 确保结果真实可信； 检 测周期短， 2个小时就能完成检测。 可以连续检 测， 结果判读简单客观， 人为误差小， 重复性好、 操作简便， 可以实现自动化、 经济省时、 可批量操 作， 具有重要的临床应用价 值。 权利要求书1页 说明书20页 附图13页 CN 114774539 A 2022.07.22 CN 114774539 A 1.一种检测多基因变异的引 物组合， 其特征在于， 所述多基因包括KRAS、 NRAS、 BRAF和 PIK3CA， 其中， 用于检测KRAS基因变异的引物分别如SEQ  ID No.1～9、 SEQ  ID No.12～16、 SEQ ID No.18～20和SEQ  ID No.23～26所示； 用于检测NRAS基因变异的引物如SEQ  ID  No.28～34、 SEQ  ID No.37～41、 SEQ  ID No.44～46和SEQ  ID No.48～49所示； 用于检测 BRAF基因变异的引物如SEQ  ID No.51～52所示； 用于检测PIK3CA 基因变异的引物如SEQ  ID  No.54～59和SEQ  ID No.62～63所示。 2.用于靶向权利要求1所述引物组合扩增产物的探针组合， 其特征在于， 靶向用于检测 KRAS基因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ  ID No.10、 SEQ  ID No.17、 SEQ  ID  No.21和SEQ  ID No.27所示； 靶向用于检测NRAS基因变异的引物的扩增产物的探针如SEQ   ID No.35、 SEQ  ID No.42、 SEQ  ID No.47和SEQ  ID No.50所示； 靶向用于检测BRAF基因变异 的引物的扩增产物的探针如SEQ  ID No.53所示； 靶向用于检测PIK3CA基因变异的引物的扩 增产物的探针分别如SEQ  ID No.60和SEQ ID No.64所示。 3.一种联合检测多基因变异的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的引物组合和 权利要求2所述的探针组合。 4.根据权利要求3所述的试剂 盒， 其特征在于， 还包括阻滞所述多基因中的至少一种的 野生型基因扩增的Bl ocker引物组合。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 用于阻滞野生型KRAS基因扩增的 Blocker引物分别如SEQ  ID No.11和SEQ  ID No.22所示； 用于阻滞野生型NRAS基因扩增的 Blocker引物分别如SEQ  ID No.36和SEQ  ID No.43所示； 用于阻滞野生型PIK3CA基因扩增 的Blocker引物分别如SEQ  ID No.61所示。 6.根据权利要求3～5任一所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括用于检测内参基因ACTB 的引物和探针， 用于检测内参基因ACTB的引物分别如SEQ  ID No.66和SEQ  ID No.68所示， 相应的探针如SEQ  ID No.67所示。 7.根据权利 要求3～4任一所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括DNA聚合酶和/或PCR扩增 缓冲液。 8.权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针在制备用于诊断或预测结直肠癌的 试剂盒中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒阻滞所述多基因中的至少一种 的野生型基因扩增的Bl ocker引物组合。 10.根据权利要求8 或9所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒基于以下步骤诊断或预测 结直肠癌： S1， 获得待测生物样本的DNA和RNA样本； S2， 利用所述试剂盒对待测生物样本的DNA和RNA样本进行检测， 获得探针的荧 光信号； S3， 根据探针荧 光信号判断所述待测生物样本是否存在相应的基因变异。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774539 A 2检测结直肠癌多基因变异的引物、 探针、 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基因检测技术领域， 具体地， 涉及一种检测结直肠癌多基因变异的引 物、 探针、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]结直肠癌发生、 发展是多个基因突变、 多个步骤积累造成的。 多个信号通路激活， 特别是EGFR依 赖的导RAS ‑RAF‑MAPK和PI3K ‑PTEN‑AKT下游信号传导通路， 在调节细胞增殖、 血管生成、 细胞运动和细胞凋亡中起到重要作用。 研究表明， 在结直肠癌患者中KRAS、 N RAS、 BRAF和PIK3 CA的基因突变频率分别为20 ‑50％、 1‑6％、 8‑15％和10 ‑30％。 [0003]临床研究发现， KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF突变的结直肠癌患者用抗EGFR抗体类药 物治疗有效率偏低， 2020年结直肠癌NCCN指南、 中国结直肠癌诊疗规范(2020  年版)及CSCO 结直肠癌诊疗指南2020版都推荐对临床确诊为复发或转移性结直肠癌病人进行KRAS、 NRAS 基因突变检测， 以指导肿瘤靶向治疗。 BRAF  V600E突变状态的评估应在RAS检测时同步进 行， 以对预后进行分层， 指导临床治疗。 [0004]目前用于基因检测的技术主要为PCR技术、 ddPCR技术和NGS技术。 ddPCR技术虽然 具有敏感度高， 精确度高、 可绝对定量等优点， 但通量低， 操作要求高， 技术有待普及， 试剂 盒研发不易， 目前还 未能在临床检测上推广应用。 而NGS技术检测周期 长， 成本高， 且不仅需 要专业的操作人员同时需配备专 业的生物信息专 业人员进 行结果解读。 P CR技术普及度高， 适合医院广泛开展， 简便快速， 特异性好， 是目前医疗市场主流的肿瘤基因突变检测产品。 在目前获批靶向药物靶点有限的情况下， P CR 技术在一段时间内依然 是主要技术。 然而， 目 前仍然缺少能够满足临床需要的检测结直肠癌多基因的试剂盒。 发明内容 [0005]为了解决上述技术问题中的至少一个， 本发明旨在提供一种联合检测结直肠癌相 关的多基因的变异情况检测的荧光PCR引物、 探针、 Blocker， 以提高结直癌基因变异检测的 灵敏度和特异性。 为此， 本发明采取的技 术方案如下： [0006]本发明第一方面提供一种检测多基因变异的引物组合， 所述多基因包括KRAS、   NRAS、 BRAF和PIK3CA， 其中， 用于检测K RAS基因变异的引物分别如SEQ  ID No. 1～9、 SEQ  ID  No.12～16、 SEQ  ID No.18～20和SEQ  ID No.23～26所示； 用于检测NRAS  基因变异的引物 如SEQ ID No.28～34、 SEQ ID No.37～41、 SEQ  ID No.44～46和SEQ  ID No.48～49所示； 用 于检测BRAF基因变异的引物如SEQ  ID No.51～52所示； 用于检测PIK3CA基因变异的引物如 SEQ ID No.54～59和SEQ  ID No.62～63所示。 [0007]在结直肠癌中， KRAS突变中95％为第 12、 13密码子突变， 该突变不影响KRAS  蛋白 与GDP和GTP的结合， 但却降低了KRAS蛋 白自身GTP酶活性， 使其水解GTP  的速率大为降低， 不断激活靶分子， 从而使 KRAS蛋白维持于活化状态， 引起信号传导的持续效应， 导致细胞大 量增殖， 从而发生恶性转化。 NRAS 基因编码的蛋白可将来自细胞外的信号传导至细胞核内，说　明　书 1/20 页 3 CN 114774539 A 3