(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210205773.8 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 中国人民解 放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100850 北京市海淀区太平路27号院 (72)发明人 王学军　黄聪　杨扬　 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于CRISPR的H5N1病毒检测新方法 (57)摘要 本发明属于生物诊断领域， 具体涉及一种可 用于检测H5N1型高致病性禽流感病毒的CRISPR ‑ Cas13a检测 新方法。 本发明基于CRISPR ‑Cas13a 技术筛选的RAA引物对和特异性的crRNA可用于 简便快速的进行H5N1病毒的检测， 其检测灵敏度 达到10copies/μl， 本发明检测系统在37 ‑42℃ 下进行等 温检测， 且与其他呼吸道病毒没有交叉 反应， 相比于其它在现场、 实验室或临床中容易 造成干扰的病原微生物检测方法， 本发明方法显 示出了较高的应用价值。 该方法可成为检测H5N1 型禽流感病毒感 染的一种快速 检测技术。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114540550 A 2022.05.27 CN 114540550 A 1.一对用于CRISPR ‑Cas13a技术检测H5N1病毒的RAA扩增引物对， 所述引物对F3和R3的 序列如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示。 2.一种用于CRISPR ‑Cas13a技术检测H5N1病毒的crRNA分子， 所述crRNA的序列如SEQ   ID NO.3所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540550 A 2一种基于CRI SPR的H5N1病毒检测新 方法 技术领域 [0001]本发明涉及生物诊断技术领域， 具体提供了一种基于C RISPR的H5N1病毒检测新方 法。 背景技术 [0002]Cas13a是一种仅靶向RNA而不靶向DNA的新型CRISPR酶。 其具有加工crRNA和crRNA 介导的RNA靶向剪切的双重活性， 在crRNA的引导下能够准确识别靶向RNA片段， 激活后特异 性剪切靶向片段。 crRNA包括短发卡结构和间隔序列， Cas13a通过识别其中的短发卡结构并 与其形成复合物， 并通过间隔序列片段识别互补靶区域， 并进 行特异性识别剪切， 它的剪切 依赖于间隔序列侧翼位点结构， 即在原间隔序列前的碱基应 当为A、 C或U。 有趣的是， 研究发 现Cas13a还具备 “附带剪切 ”的非特异性的RNA核糖核苷酸酶(RNase)活性， 在识别RNA并进 行特异性剪切之后， 并没有失去活性， 随后会对附近的单链RNA片段继续进行无差别的剪 切。 2017年4月 ， 美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)， 特异性达到单碱基 的核酸检测技术——基于CRISPR ‑Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific  High  Sensitivity  Enzymatic  Reporter  UnLOCKing)， 利用Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪 切活性， 结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase  Polymerase   Amplification， RPA)， 将样本中DNA或RNA进行扩增， 扩增后的DNA在进行T7核糖核酸聚合酶 介导的转录后， 引入Cas13a工具进 行检测， 一旦含有 标靶RNA序列， 便会 大量剪切报告分子， 检测到荧 光信号， 使得检测阈值可以达 到单拷贝 级别。 [0003]甲型H5N1流感病毒， 是甲型流感病毒的一个高致病性亚型， 具有血凝素第5型， 神 经氨酸酶第1型。 H5N1病毒起源于家禽和野生鸟类， 可传染给人类。 自2003年11月以来， 亚 洲、 非洲、 太平洋、 欧洲和中东的15个国家报告了约700例人感染高致病性H5N1型禽流感。 2021年7月21日， 印度全印医学科学院报道， 1名11岁男童因感染H5N1型禽流感病毒于当日 在该机构死亡。 而快速诊断对于尽早地发现流感病毒的存在， 防止病毒的进一步传播具有 重要意义。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种基于CRISPR与重组酶介导等温核酸扩增技术 (Recombinase  Aided Amplification， RAA)结合的检测H5N1病毒的新方法。 该方法包括以 下步骤： [0005]1、 合成与纯化携带HA基因的质粒， 体外转录mRNA， 模拟病毒 核酸样本 。 [0006]2、 设计RT ‑RAA引物对核酸样本进行扩增反应 [0007]参与该反应的试剂为： 步骤1获得的核酸样本、 上游引物、 下游引物、 Buffer  A、 Buffer B(来自杭州众测生物科技有限公司) [0008]所述RT‑RAA扩增的反应条件为： 37 ‑42℃反应3 0min [0009]所述RT‑RAA扩增引物由S EQ ID NO.1所示的单链DNA分子和S EQ ID NO.2所示的单说　明　书 1/4 页 3 CN 114540550 A 3