(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210214296.1 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技 术 开发区新江大路8号 申请人 武汉庆发禾盛农业发展 有限公司 (72)发明人 周俊飞　彭海　朱晓波　陈利红　 周旭升　陈耀东　李甜甜　肖华锋　 方治伟　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 刘杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测棉花转基因品系的引物对组合、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 特别涉及一种检 测棉花转基因品系的引物对组合、 试剂盒及检测 方法。 所述引物对组合的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1至SEQ  ID NO.24所示； 避免了传统Real ‑ time PCR技术一次只能实现一个目的， 需要进行 多次扩增和检测才能覆盖样本中的多个靶标转 基因成分， 避免了现有技术在进行多重PCR时， 出 现较多的假阳性和假阴性结果， 可以通过一次高 通量测序和分析， 进行9个以上的多重PCR反应， 无需每组引物单独检测， 因此大大提高了检测效 率。 权利要求书1页 说明书13页 序列表6页 附图1页 CN 115491428 A 2022.12.20 CN 115491428 A 1.一种检测棉 花转基因品系的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合包括： 特异性 扩增MON15985a的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示； 特异性扩增MON1445的引物对， 包括2对引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3至SEQ  ID  NO.6所示； 特异性扩增MON8 8913的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； 特异性扩增GHB614的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9至SEQ  ID NO.10所示； 特异性扩增LLcotton25的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ  ID NO.12所 示； 特异性扩增DAS ‑24236‑5的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13至SEQ  ID NO.14所 示； 特异性扩增DAS ‑21023‑5的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.15至SEQ  ID NO.16所 示； 特异性扩增MON5 31的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17至SEQ  ID NO.18所示； 特异性扩增GHB1 19的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.19至SEQ  ID NO.20所示； 特异性扩增T3 04‑40的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.21至SEQ  ID NO.22所示； 和/或， 特异性扩增MON88701的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.22至SEQ  ID NO.24 所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合包括特异性扩增选 自下组的棉花转基因品系特异性序列的引物对： MON15985a、 MON1445、 MON88913、 GHB614、 LLcotton25、 DAS‑24236‑5、 DAS‑21023‑5、 MON531、 GHB119、 T304‑40和MON8 8701。 3.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增棉 花内参基因Gh_Sad1和Gh_SAH7的引物对。 4.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 扩增棉花内参基因Gh_Sad1的引物 对的两对引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.25‑SEQ ID NO.28所示。 5.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 扩增棉花内参基因Gh_SAH7的引物 对的两对引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.29‑SEQ ID NO.32所示。 6.一种检测棉花转基因品系的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1 ‑5任意 一项所述引物对组合。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括第一容器， 所述第一容 器内含有所述引物对组合。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括多重PCR预混液。 9.权利要求1 ‑5任意一项所述的引物对组合或权利要求6 ‑8任意一项的所述的试剂盒 在检测棉花 转基因品系及其相关产品中的应用。 10.一种检测棉花 转基因品系的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 得到待测棉花的DNA和权利要求1 ‑5任意一项所述的引物对组合； 以所述DNA为模板， 将所述引物对组合加入反应 体系中， 进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通 量测序， 得到高通 量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 得到检测棉花 转品系的结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115491428 A 2检测棉花转基因 品系的引物对组合、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 特别涉及一种检测棉花转基因品系的引 物对组合、 试 剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]棉花(Gossypium  hirsutumL.)是我国重要的经济作 物之一， 其种植、 加工、 纺织等 相关从业人员众多， 对农村经济的发展和农民的经济 收入具有非常重要的影响， 是关系国 计民生的重要战略物资。 长期以来， 以杂交育种为主的传统育种技术在提高棉花产量、 纤维 品质以及抗逆性等方面取得了一定进展， 并获得了可观的社会效益和经济效益。 现代生物 技术尤其植物基因工程的迅速发展为棉花种质资源创新提供了新的思路和方法， 它可以打 破物种间的生殖隔离， 通过直接或间接的转移手段有目的、 有计划 地向棉花体内引入控制 性状遗传的优良基因， 在无需改变原有 特性的条件 下， 打破基因不良连锁， 实现生物性状的 定向改变。 利用转基因技术手段提高棉花产量、 改良纤维品质以及增强抗虫、 抗病和抗逆 性， 是常规育种的重要补 充。 随着社会对转基因产品安全性问题的日益关注， 农产品中的转 基因成分检测已纳 入国内外检验检疫部门的检测项目并逐渐得到加强。 因此， 开发 高效、 便 捷的转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 目 前基于核酸的P CR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通定 性PCR、 巢式PCR、 环介导等温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相对于普通定 性PCR方法， 巢式P CR高了检测的灵敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性 强， 然而引 物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通的多重P CR方法 可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过六重， 否则引物之间干扰较大， 影响检 测效果。 基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通量、 灵 敏度高、 特异性 强等优点， 且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因 作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些因 素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0004]因此， 研发一种高效、 灵敏和鉴定的转基因产品检测方法十分重要。 发明内容 [0005]本申请提供了一种检测棉花转基因品系的引 物对组合、 试剂盒及检测方法， 以解 决如何高效快速鉴定棉花 转基因品系的技 术问题。 [0006]第一方面， 本申请提供了一种检测棉花转基因品系的引 物对组合， 所述引 物对组 合包括 [0007]特异性扩增MON15985a的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所 示；说　明　书 1/13 页 3 CN 115491428 A 3