(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210211673.6 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技 术 开发区新江大路8号 申请人 武汉庆发禾盛农业发展 有限公司 (72)发明人 方治伟　彭海　周旭升　朱晓波　 陈耀东　周俊飞　李论　陈利红　 高利芬　李甜甜　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 刘杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测水稻转基因品系的引物对组合、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本申请涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测水稻转基因品系的引物对组合、 试剂盒及检测 方 法 。所 述 引物 对组 合的 核 苷 酸 序 列 如 SEQIDNO.1至SEQIDNO.26所示； 所述引物对组合 的扩增产物可以进行一次高通量测序和分析， 得 到多个检测结果， 避免了现有技术在进行多重 PCR时， 出现较多的假阳性或假阴性结果； 同时利 用本申请的引物在进行样品检测时可以实现一 个样品9个以上靶标分子的多重PCR扩增或者多 个样品中多个靶标的多重PCR扩增， 然后通过一 次高通量测序和分析， 获得一种转基因作物中多 个靶标或多种转基因作物中多个靶标分子的检 测结果， 大大提高了检测的效率和灵敏度， 便于 应用推广。 权利要求书1页 说明书13页 序列表5页 附图1页 CN 114657276 A 2022.06.24 CN 114657276 A 1.一种检测水稻转基因品系的引物对组合， 其特 征在于， 所述引物对组合中： 特异性扩增Bt6 3的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.4所示； 特异性扩增G6 H1的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； 特异性扩增L LRICE62的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； 特异性扩增L LRICE601的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9至SEQ  ID NO.10所示； 特异性扩增K F2的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ ID NO.12所示； 特异性扩增K F8的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13至SEQ ID NO.14所示； 特异性扩增KMDF1的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.15至SEQ ID NO.16所示； 特异性扩增T1C ‑9的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17至SEQ  ID NO.18所示； 特异性扩增M12的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.19至SEQ  ID NO.20所示； 特异性扩增T2A ‑1的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.21至SEQ  ID NO.22所示； 和/ 或， 特异性扩增K efeng6的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.23至SEQ ID NO.26所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合包括特异性扩增选 自下组的水稻转基因品系特异性序列的引物对： Bt63、 G6H1、 LLRICE62、 LLRICE601、 KF2、 KF8、 KMDF1、 T1C ‑9、 M12、 T2 A‑1和Kefeng6； 所述引物对组合还 包括内参基因PLD的引物对。 3.根据权利要求3所述的引物对组合， 其特征在于， 所述特异性扩增PLD的引物对包括： 第一对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.27至SEQ  ID NO.28所示； 第 二对， 其核苷酸序列如SEQ   ID NO.29至SEQ ID NO.30所示。 4.一种检测水稻转基因品系的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1 ‑3任意 一项所述的引物对组合。 5.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括多重PCR预混液。 6.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述引物对组合的对数 范围为1‑13对。 7.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括第一容器， 所述第一容 器内含有所述引物对组合。 8.一种如权利要求1 ‑3任意一项所述的引物对组合用于检测水稻转基因品系的方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： 得到待测水稻的DNA和引物对组合； 以所述DNA为模板， 将所述引物对组合加入反应 体系中， 进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通 量测序， 得到高通 量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 得到检测水稻转基因品系的结果。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述高通 量文库的浓度≥2ng/ul。 10.引物对组合的用途， 其特征在于， 用于制备检测试剂盒， 所述检测试剂盒用于检测 水稻转基因的品系； 所述引物对组包括序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.26所示的引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657276 A 2检测水稻转基因 品系的引物对组合、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本申请涉及生物技术领域， 尤其涉及一种检测水稻转基因品系的引 物对组合、 试 剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]水稻是我国最重要的口粮作物， 在保证我国粮食安全方面具有重要意义。 转基因 技术在水稻不同品系中的应用， 提高了水稻品种的产量、 抗 性、 适应性 等综合性状。 [0003]随着大量转基因产品流入市场， 因此开发鉴定转基因品系的方法提上日程， 转基 因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 Wester n印迹法、 酶联免疫吸附法(ELISA)、 免疫试纸条和蛋白质芯片等方法是目前主要的基于蛋白的检测 方法。 [0004]目前基于核酸的PC R检测方法主要是多重PC R方法， 可以在一个反应中同时检测多 个基因， 但常规的电泳检测结果很难判断， 容易出现假阳性或假阴性结果； 而常用的Real ‑ time方法检测一次PCR反应中检测的外源基因数量也有限且成本高昂， 需要专门的仪器设 备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些因素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0005]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因品系的产品和检测方法， 成为亟待解 决的关键问题。 发明内容 [0006]本申请提供了一种检测水稻转基因品系的引 物对组合、 试剂盒及检测方法， 以解 决现有常用的基于多重P CR反应的检测水稻的试剂盒无法实现8重以上的P CR引物扩增的技 术问题。 [0007]第一方面， 本申请提供了一种检测水稻转基因品系的引 物对组合， 所述引 物对组 合中： [0008]特异性扩增Bt6 3的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  I DNO.4所示； [0009]特异性扩增G6 H1的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； [0010]特异性扩增LLRICE62 的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所 示； [0011]特异性扩增LL RICE601的引物对， 其核苷酸序列如S EQ ID NO.9至SEQ ID NO.10所 示； [0012]特异性扩增K F2的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ ID NO.12所示； [0013]特异性扩增K F8的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13至SEQ ID NO.14所示； [0014]特异性扩增KMDF1的引物对， 其核苷酸序列如SE  QID NO.15至SEQ ID NO.16所示； [0015]特异性扩增T1C ‑9的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17至SEQ  ID NO.18所示； [0016]特异性扩增M12的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.19至SEQ  ID NO.20所示； [0017]特异性扩增T2A ‑1的引物对， 其核苷酸序列如S EQ ID NO.21至S EQ ID NO.22所示；说　明　书 1/13 页 3 CN 114657276 A 3