(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210211687.8 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 广东省人民医院 地址 510080 广东省广州市越秀区中山 二 路106号广东省人民医院主体楼 24楼 (72)发明人 顾兵　胡雪姣　赵云虎　刘素玲　 周晖　张莉滟　凌勇　张鑫强　 袁凯旋　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 张柳 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12Q 1/04(2006.01) (54)发明名称 基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 特别涉及基于液 滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒。 本发明提供 了具有如SEQ  ID NO.1～6所示核苷酸序列的引 物、 具有如SEQ  ID NO.7和8所示核苷酸序列的探 针。 本发明灵敏性好， 远低于荧光定量PCR的检测 限， 避免可能出现的假阴性； 可同时进行两个检 测通道和一个内控通道的检测， 减少了多次加样 可能造成的污染； 多重数字PCR实现芯片内液滴 数的绝对定量， 无需依赖标准曲线， 定量结果更 加准确。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图5页 CN 114381458 A 2022.04.22 CN 114381458 A 1.引物， 其特 征在于， 具有： (I)、 如SEQ  ID NO.1～6中任意所示的核苷酸序列； 或 (II)、 如(I)所示的核苷酸序列的互补序列； 或 (III)、 如(I)或(II)所示的苷酸序列经取代、 缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷 酸序列， 且功能与(I)或(I I)的相同或相似， 所述多个为2个至10个； 或 (IV)、 与(I)～(I II)任意所示的核苷酸序列同源性达 到不低于80％的核苷酸序列。 2.探针， 其特 征在于， 具有： (V)、 如SEQ  ID NO.7和/或SEQ  ID NO.8所示的核苷酸序列； 或 (VI)、 如(V)所示的核苷酸序列的互补序列； 或 (VII)、 如(V)或(VI)所示的核苷酸序列经取代、 缺失或添加一个或多个碱基获得的核 苷酸序列， 且功能与(V)或(VI)的相同或相似， 所述多个为2个至10个； 或 (VIII)、 与(V)～(VI I)任意所示的核苷酸序列同源性达 到不低于80％的核苷酸序列。 3.如权利要求2所述的探针， 其特 征在于， 具有VIC荧 光基团和/或MGB。 4.引物探针组， 其特征在于， 包括如权利要求1所述的引物和/或如权利要求2或3所述 的探针。 5.如权利要求1所述的引物、 如权利要求2或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引 物探针组在制备东方恙虫的定性和/或定量试剂盒中的应用。 6.试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1所述的引物、 如权利要求2或3所述的探针和/ 或如权利要求 4所述的引物探针组， 以及可接受的辅料和/或助剂。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于， 其反应 体系包括： 3 μL 5X mix； 0.15 μL初始浓度为10 0 μM的上游引物； 0.15 μL初始浓度为10 0 μM的下游引物； 0.0375 μL初始浓度为10 0 μM的探针； 模板和ddH2O； 共15 μL。 8.如权利要求6或7所述的试剂盒， 其特征在于， 其扩增程序包括： 95℃预变性5min； 95 ℃变性15s， 5 6～62℃退火延伸3 0s， 返回变性然后退火延伸， 如此循环39次。 9.东方恙虫的检测方法， 其特征在于， 包括使用如权利要求1所述的引物、 如权利要求2 或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物探针组对待测样品扩增、 检测； 或使用如权利 要求6至8任一项所述的试剂盒对待测样品进行扩增检测。 10.检测装置， 其特征在于， 包被有如权利要求1所述的引物、 如权利要求2或3所述的探 针和/或如权利要求 4所述的引物探针组。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381458 A 2基于液滴PCR的东方恙虫定量 检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 特别涉及基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒。 背景技术 [0002]恙虫病是由东方恙虫感染导致的自然疫源性疾病， 中间宿主是恙螨， 主要通过叮 咬传播至人体。 恙虫病的主要症状包括发烧、 皮疹、 肌痛、 淋巴结肿大、 恶心、 呕吐、 焦痂(在 螨咬伤部位出现黑点)、 腹痛和非特异 性流感等， 同时可能会有多种并发症： 黄疸、 急性肾功 能衰竭和弥散性血管内凝血(DIC)、 急性呼吸窘迫综合征、 心肌炎和脑膜脑炎， 甚至多器官 衰竭。 令人头疼 的是， 恙虫病的症状与钩端螺旋体病、 登革热、 布鲁氏菌病和伤寒等疾病类 似， 这使得鉴别诊断十分困难。 恙螨叮咬部位出现焦痂是临床诊断恙虫病的特异性标志物 (98.9％)， 然而， 焦痂的存在在患者中的差异很大， 从7％～97％不等， 尤其是印度和其他亚 洲人群中焦痂的存在量很少， 不适合用于诊断东方恙虫， 因此， 诊断更依赖于实验室检测。 恙虫病的实验室诊断依赖于血清学检测， 如Weil ‑Felix检测、 间接免疫荧光检测、 间接免疫 过氧化物酶检测、 酶联免疫吸附检测(ELISA)和免疫层析检测(ICT)等， 其中ELISA检测IgM 对诊断恙虫病最为可靠。 然而， 血清学检测仍存在灵敏度特异性不足、 操作繁琐、 技术要求 高， 成本需求大等 弊端， 尤其是灵敏度不够， 限制了其诊断价 值。 [0003]另一方面， 基于分子的方法， 如聚合酶链反应(PCR)， 对恙虫病的诊 断具有应用价 值。 目前， P CR具有检测周期短、 高灵敏高特异 等优点， 同时， 定量PCR可用于监测治疗效果和 预后评估， 极具临床意义。 主流的分子检测以荧光定量PCR为主， 但随着技术的发展， 新一代 分子检测技术——数字PCR逐渐崭露头角。 数字PCR(DigitalPCR， dPCR)是一种核酸分子绝 对定量技术， 其核心是通过大规模单分子扩增实现拷贝数 的直接绝对定量， 直接获知目标 核酸分子的个数， 提高了检测灵敏度和准确度。 数字PCR具有超高灵敏度、 高特异 性、 绝对定 量、 高耐受性 等优势， 能够早期、 快速、 准确、 定量的诊断东方恙虫。 [0004]而荧光定量PCR的灵敏度低于数字PCR， 可造成漏检， 出现假阴性； 再者， 荧光定量 PCR通常只能做到两个荧光通道同时检测， 无法兼顾内控通道。 或者检测 两份， 即分别采用 两个基因和一个内控基因构成检测体系； 最后， 荧光定量P CR实现拷贝 数的定量依赖于标准 曲线， 经已知浓度标准品推算未知浓度的样本， 没有实现真正的绝对定量。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒， 该引物或试剂 盒具有灵敏度高、 多靶标性、 绝对定量的优点。 [0006]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： [0007]本发明提供了引物， 其具有： [0008](I)、 如SEQ  ID NO.1～6中任意所示的核苷酸序列； 或 [0009](II)、 如(I)所示的核苷酸序列的互补序列； 或 [0010](III)、 如(I)或(II)所示的苷酸序列经取代、 缺失或添加一个或多个碱基获得 的说　明　书 1/9 页 3 CN 114381458 A 3