(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210213873.5 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技 术 开发区新江大路8号 (72)发明人 李甜甜　彭海　陈利红　李论　 高利芬　周俊飞　方治伟　肖华锋　 万人静　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 刘杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测棉花转基因成分的引物对组合、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 特别涉及一种检 测棉花转基因成分的引物对组合、 试剂盒及检测 方法。 所述引物对组合包括核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1至SEQ  ID NO.66所示。 所述引物对组合的扩 增产物可以进行一次高通量测序和分析， 得到多 个检测结果， 避免了传统Real ‑time PCR技术一 次只能实现一个靶标分子的检测， 避免了现有技 术在进行多重PCR时， 出现较多的假阳性和假阴 性结果， 一次高通量测序和分析可 以进行9个以 上的PCR反应， 提高了检测效率， 同时兼顾了检测 的通量与成本 。 权利要求书2页 说明书18页 序列表12页 附图1页 CN 114774566 A 2022.07.22 CN 114774566 A 1.一种检测棉花 转基因成分的引物对组合， 其特 征在于， 所述引物对组合包括： 特异性扩增p3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示； 特异性扩增t3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3至SEQ ID NO.4所示； 特异性扩增pNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5至SEQ ID NO.6所示； 特异性扩增pFMV3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； 特异性扩增tNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9至SEQ  ID NO.10所示； 特异性扩增pZmUbi的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ ID NO.12所示； 特异性扩增tE9的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13至SEQ ID NO.14所示； 特异性扩增t7s的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.15至SEQ ID NO.16所示； 特异性扩增PAT的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17至SEQ  ID NO.18所示； 特异性扩增bar的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.19至SEQ  ID NO.20所示； 特异性扩增pS7S7的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.21至SEQ  ID NO.22所示； 特异性扩增NPtI I的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.23至SEQ ID NO.24所示； 特异性扩增tORF25的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.25至SEQ ID NO.26所示； 特异性扩增pTsf1的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.27至SEQ  ID NO.28所示； 特异性扩增cry1F的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.29至SEQ ID NO.30所示； 特异性扩增CTP2的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.31至SEQ  ID NO.32所示； 特异性扩增Cry1Ac的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.33至SEQ ID NO.34所示； 特异性扩增CryAb/Ac的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.35至SEQ ID NO.36所示； 特异性扩增Cry2 Ae的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.37至SEQ  ID NO.38所示； 所示特异性扩增Cry2 Ab的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.39至SEQ  ID NO.40； 特异性扩增CpTI的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.41至SEQ  ID NO.42所示； 特异性扩增H4A ‑terminator的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.43至SEQ  ID NO.44 所示； 特异性扩增H3At ‑intron的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.45至SEQ  ID NO.46所 示； 特异性扩增pH4A748的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.47至SEQ  ID NO.48所示； 特异性扩增2mepsps的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.49至SEQ  ID NO.50所示； 特异性扩增cp4epsps的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.51至SEQ  ID NO.52所示； 特异性扩增tOCS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.53至SEQ ID NO.54所示； 特异性扩增pCSVMV的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.55至SEQ ID NO.56所示； 特异性扩增TpS SuAT的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.57至SEQ  ID NO.58所示； 特异性扩增pCISV的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.59至SEQ  ID NO.60所示； 特异性扩增zmhsp的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.61至SEQ  ID NO.62所示； 特异性扩增Tev ‑5UTR的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.63至SEQ ID NO.64所示； 和/或， 特异性扩增DMO的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.65至SEQ ID NO.66所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增棉 花内参基因Gh_Sad1和Gh_SAH7的引物对。 3.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 扩增棉花内参基因Gh_Sad1的引物权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114774566 A 2对包括两对引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.67‑SEQ ID NO.70所示。 4.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 扩增棉花内参基因Gh_SAH7的引物 对包括两对引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.71‑SEQ ID NO.74所示。 5.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括特异性扩增 选自下组的棉花转基因元件的引物对： p35S、 t35S、 pNOS、 pFMV35S、 tNOS、 pZmUbi、 tE9、 t7s、 PAT、 bar、 pS7S7、 NPtII、 tORF25、 pTsf1、 cry1F、 CTP2、 Cry1Ac、 CryAb/Ac、 Cry2Ae、 Cry2Ab、 CpTI、 H4A ‑terminator、 H3At ‑intron、 pH4A748、 2mepsps、 cp4epsps、 tOCS、 pCSVMV、 TpSSuAT、 pCISV、 zmhsp、 Tev ‑5UTR和DMO。 6.一种检测棉花转基因成分的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1 ‑5任意 一项所述的检测棉花 转基因成分的所述引物对组合。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括第一容器， 所述第一容 器内含有所述引物对组合。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括多重PCR预混液。 9.权利要求1 ‑5任意一项所述的引物对组合或权利要求6 ‑8任意一项所述的试剂盒在 检测转基因棉花及其相关产品中的应用。 10.一种检测棉花 转基因成分的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 得到待测棉花的DNA和权利要求1 ‑5任意一项所述的引物对组合； 以所述DNA为模板， 将所述引物对组合加入反应 体系中， 进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通 量测序， 得到高通 量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 得到检测棉花 转基因成分的结果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114774566 A 3