(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210211896.2 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 广东省人民医院 地址 510080 广东省广州市越秀区中山 二 路106号广东省人民医院主体楼 24楼 (72)发明人 顾兵　简旭华　胡雪姣　赵云虎　 周茂华　王维腾　甘礼溪　陈欧迪　 张鑫强　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 张柳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/38(2006.01) C12R 1/44(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/725(2006.01) C12R 1/22(2006.01) (54)发明名称 检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字 PCR试剂盒 (57)摘要 本发明涉及检测技术领域， 特别涉及检测感 染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒。 本发明提供了引物探针组合， 其具有包括如SEQ   ID No.1～SEQ  ID No.39中任 意所述的核苷酸序 列。 本发明主要检测链 球菌、 金黄色葡萄球菌、 凝 固酶阴性葡萄球菌、 肠球菌、 白色念珠菌、 铜绿假 单胞菌、 嗜麦芽窄食假单胞菌、 大肠埃希菌、 肺炎 克雷伯菌、 鲍曼不动杆菌、 立克次体和巴尔通体 共12种能引起感染性心内膜炎的病原 体， 单次能 够检测4个检测通道和1个内控通道、 对12种无关 的人类常见病原 体无非特异性扩增、 能够进行绝 对定量。 权利要求书1页 说明书10页 序列表7页 附图20页 CN 114438238 A 2022.05.06 CN 114438238 A 1.引物探针组合， 其特 征在于， 包括如下组合中的一种或两种以上： 组合X： (1)、 上游引物具有如SEQ  ID No.(3X‑2)所示的核苷酸序列； 和/或 (2)、 下游引物具有如SEQ  ID No.(3X‑1)所示的核苷酸序列； 和/或 (3)、 探针具有如SEQ  ID No.(3X)所示的核苷酸序列； 和/或 (4)、 如(1)～(3)任意所示的核苷酸序列经取代、 缺失或添加一个或多个碱基获得的核 苷酸序列， 且功能与(1)～(3)的相同或相似； 和/或 (5)、 与(1)～(4)任意所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列； 其中， X选自1～13中的任意整数； 所述多个为2个至 5个。 2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测链球菌、 金黄色葡萄球菌、 凝 固酶阴性 葡萄球菌、 肠球菌、 白色念珠菌、 铜绿假单胞菌、 嗜麦芽窄食假单胞菌、 大肠埃希菌、 肺炎克 雷伯菌、 鲍曼不动杆菌、 立克次体和/或巴尔通体的试剂、 试剂盒和/或装置中的应用。 3.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测感染性心内膜炎的试剂、 试剂 盒和/或 装置中的应用。 4.如权利 要求2或3所述的应用， 其特征在于， 所述检测包括提取核酸、 微液滴生成、 PCR 扩增和/或芯片扫描。 5.如权利 要求2至4任一项所述的应用， 其特征在于， 所述检测的反应体系为15 μL， 包括 3 μL的5×mix、 0.15 μL的100 μM的上游引物、 0.15 μL的100 μM的下游引物、 0.03 75 μL的100 μM的 探针和/或模板 。 6.如权利要求2至 5任一项所述的应用， 其特 征在于， 所述检测的反应程序为： 7.试剂， 其特征在于， 包括如权利要求1所述的引物探针组合以及可接受的辅料和/或 助剂。 8.试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1所述的引物探针组合以及可接受的辅料和/ 或助剂。 9.检测装置， 其特征在于， 包括包被有如权利要求1所述的引物探针组合， 以及可接受 的部件。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438238 A 2检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及检测技术领域， 特别涉及检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字 PCR试剂盒。 背景技术 [0002]感染性心内膜炎(Infect ive endocarditis， IE)指因病原体直接侵犯心脏瓣膜而 引起的一系列以瓣膜受累为特征的致命性疾病。 活动期感染性心内膜炎(Active   infective  endocarditis， AIE)以血流动力学紊乱、 难以控制的脓毒血症、 瓣周脓肿、 脑动 脉瘤或脑出血、 或大赘生物为主要临床表现。 感染性心内膜炎患者早期症状缺乏特异性， 首 次就诊可出现在多个科室， 临床通常采用传 统或改良的Duke标准来诊断疑似IE的患者。 近 些年， IE的发病率呈明显增加趋势， 尤其是老年人和住院患者中， 风险因素主要包括细菌耐 药、 人工瓣膜置换术、 植入器械术以及各种血管内检查治疗操作、 年龄、 血液透析、 静脉注 射 毒品等。 对于病原体诊断， 血培养是公认的金标准， 然而， 血培养检测周期长、 污染风险、 采 血量大、 多菌复合检测能力差， 且由于既往抗生素治疗、 微生物量少、 病原体生长缓慢等其 他因素， 约30％的IE患者的血培养假阴性， 而且苛养微生物 等非典型病原体无法培养， 导致 感染性心内膜炎的诊断和治疗存在滞后性、 不科学性、 滥用抗菌药物等问题。 此外， 由于抗 生素治疗和污染， 瓣膜培养结果存在争议。 综上所述， IE由于临床症状不典型、 心 内结构破 坏严重、 血培养困难、 病情进展迅速、 病人院内死亡率高(15％～20％)等特点， 往往在早期 诊断和对症治疗上存在困难， 亟需研发快速、 灵敏的分子诊断方法对IE的多种病原体进行 精准检测。 [0003]目前， 不依赖培养的聚合酶链式反应(PCR )具有检测周期短、 高灵敏高特异等优 点， 同时， 定量P CR可用于监测治疗效果和预后评估， 在 诊断IE的病原体方面逐渐得到认可。 主流的分子检测以荧光定量PCR为主， 但随着技术的发展， 新一代分子检测技术——数字 PCR逐渐崭露头角。 数字PCR(Digital  PCR， dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术， 其核心是 通过大规模单分子扩增实现拷贝数 的直接绝对定量， 直接获知目标核酸分子的数目， 提高 了检测灵敏度和准确度。 数字PCR具有超高灵敏度、 高特异性、 绝对定量、 高耐受性等优势， 能够为IE提供早期、 快速、 准确、 定量的病原菌诊断结果。 [0004]与本发明最接近的技术方案为荧光定量PCR技术， 步骤： a.核酸提取； b.荧光定量 PCR反应体系配制； c.扩增， 收集 荧光信号； d.标准曲线和CT值确定病原体 拷贝数。 [0005]但荧光定量PCR技 术的缺点主要有： [0006](1)荧光定量PCR的灵敏度低于数字PCR， 可造成漏检， 出现假阴性； [0007](2)荧光定量PCR通常只能做到两个荧光通道同时检测， 无法兼顾内控通道； 或者 检测两份， 即 分别采用两个 基因和一个内控基因构成检测体系； [0008](3)荧光定量PC R实现拷贝数的定量依赖于标准曲线， 经已知浓度标准品推算未知 浓度的样本， 没有实现真正的绝对定量。说　明　书 1/10 页 3 CN 114438238 A 3