(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210211578.6 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技 术 开发区新江大路8号 (72)发明人 肖华锋　李论　彭海　方治伟　 陈利红　李甜甜　高利芬　周俊飞　 万人静　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 刘杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测转基因苜蓿的引物对组合、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本申请涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测转基因苜蓿的引物对组合、 试剂盒及检测方 法。 所述引物对组合其核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1至SEQ  ID NO.18所示； 通过本申请的引物组 合， 操作简单， 经过一次样品前处理， 单管PCR扩 增， 文库构建与测序就可以同步检测多样品或一 个样品中多种转基因成分， 具有平行分析和多重 判断的特点， 大大提升了转基因产品的检测效 率， 节约了 检测成本 。 权利要求书1页 说明书12页 序列表4页 附图1页 CN 114657275 A 2022.06.24 CN 114657275 A 1.一种检测转基因苜蓿的引物对组合， 其特 征在于， 所述引物对组合包括： 特异性扩增p3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示； 特异性扩增t3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3至SEQ ID NO.4所示； 特异性扩增pNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5至SEQ ID NO.6所示； 特异性扩增tNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； 特异性扩增pFMV3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9至SEQ  ID NO.10所示； 特异性扩增PAT的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ ID NO.12所示； 特异性扩增bar的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13至SEQ ID NO.14所示； 特异性扩增NPtI I的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.15至SEQ ID NO.16所示； 和/或， 特异性扩增cp4epsps的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17至SEQ  ID NO.18 所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括特异性扩增 选自下组的苜蓿转基因品系的引物对： Ms_J 163和/或Ms_J 101。 3.根据权利要求2所述的引物对组合， 其特 征在于， 所述引物对组合包括： 特异性扩增Ms_J 163的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.19至SEQ  ID NO.20所示； 和/或， 特异性扩增Ms_J101的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.21至SEQ  ID NO.22 所示。 4.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述特异性扩增Ms_Acc的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.23至SEQ ID NO.24所示。 5.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括特异性扩增 选自下组的苜蓿转基因元件的引物对： p35S、 t35S、 pNOS、 tNOS、 pFMV35S、 PAT、 bar、 NPtII和 cp4epsps。 6.一种检测转基因苜蓿的引物对组合的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括： 权利要 求1‑5任意一项所述的引物对组合。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括多重PCR预混液。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括第一容器， 所述第一 容器内含有所述引物对组合。 9.一种如权利要求1 ‑5任意一项所述的引物对组合用于检测转基因苜蓿的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 得到待测苜蓿的DNA和所述引物对组合； 以所述DNA为模板， 将所述引物对组合加入反应 体系中， 进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通 量测序， 得到高通 量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 得到检测转基因苜蓿的结果。 10.苜蓿引物对组合的用途， 其特征在于， 所述引物对组合用于制备并检测苜蓿转基因 成分和转基因品系； 所述引物对组包括序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.24所示的引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657275 A 2一种检测转基因苜蓿的引物对组合、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本申请涉及生物技术领域， 尤其涉及一种检测转基因苜蓿的引 物对组合、 试剂盒 及检测方法。 背景技术 [0002]苜蓿是一种豆科多年生牧草， 具备高营养、 高产量、 适应力强等特点。 同时， 苜蓿是 一种高蛋白， 因蛋白质含量高、 含多种矿物元素、 维生素和碳水化合物丰富以及能进 行生物 固氮等优点， 在 农牧业生产中发挥着重要的作用， 具有很高的经济和生态价 值。 [0003]传统的栽培方法具有时间长， 产量低， 成本高的局限性， 无法满足现今社会对于育 种多元化的需求。 随着转基因技术的不断发展， 植物转基因技术在苜蓿的遗传改良中具有 极高的应用价值， 从根本上加大育种进程， 提高生产产量以及质量。 但是转基因苜蓿被直接 或间接地制成食品以及国际社会对转基因产品安全性问题的日益关注， 农产品中的转基因 成分检测已纳 入国内外检验检疫部门的检测项目并逐渐得到加强。 因此， 开 发高效、 便捷的 转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0004]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 目 前基于核酸的P CR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通定 性PCR、 巢式PCR、 环介导等温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相对于普通定 性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性 强， 然而引 物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通的多重P CR方法 可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过6重， 否则引物之间干扰较大， 影响检 测效果。 基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通量、 灵 敏度高、 特异性 强等优点， 且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因 作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些因 素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0005]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决的关键 问题。 发明内容 [0006]本申请提供了一种检测转基因苜蓿的引 物对组合、 试剂盒及检测方法， 以解决基 于定量PCR技 术检测转基因苜蓿通 量低且检测成本高的技 术问题。 [0007]第一方面， 本申请提供了一种检测转基因苜蓿的引 物对组合， 所述引 物对组合包 括： [0008]特异性扩增p3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示； [0009]特异性扩增t3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3至SEQ ID NO.4所示； [0010]特异性扩增pNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5至SEQ ID NO.6所示；说　明　书 1/12 页 3 CN 114657275 A 3