(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210213669.3 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 东北农业大 学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区长 江路600号 (72)发明人 姜毓君　满朝新　秦雪　杨鑫焱　 付世骞　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 邓宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物 对、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物 对、 试剂盒及检测方法， 属于食品安全技术领域。 为了解决现有技术检测克罗诺杆菌存在的问题， 本发明提供了一种更简单、 快速的aRPA可视化检 测方法。 所述检测方法的检测原理为以阪崎克罗 诺杆菌特异性靶基因设计引物， 通过不对称RPA 产生大量富含G的ssDNA， 形 成的G‑四联体与血红 素形成具有过氧化物酶活性的DNA酶， 催化H2O2 和底物TMB的反应产生明显蓝色产物， 实现阪崎 克罗诺杆菌的可视化检测。 本发 明获得的可视化 检测方法具有简单、 快速和灵敏度高等特点， 可 用于实时和现场检测食品及食品加工过程中的 阪崎克罗诺杆菌污染， 尤其是婴幼儿配方奶粉生 产中的克罗诺杆菌 污染。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图7页 CN 114561480 A 2022.05.31 CN 114561480 A 1.一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对， 其特征在于， 所述RPA引物对基于阪崎 克罗诺杆菌基因设计， 所述RPA引物对中的上游引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游 引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种用于可视化检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权利 要求1所述的RPA引物对。 3.一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的aRPA可视化检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取样品中的DNA； (2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板， 采用RPA引物对进行RPA扩增反应， 获得 RPA扩增产物； 所述RPA引物对中的上游引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游引物核苷 酸序列如SEQ  ID NO.2所示； (3)将步骤(2)获得的RPA扩增产物与KCl缓冲液混合， 加入氯化血红素溶液孵育， 再加 入TMB溶液孵育， 观察反应产物的颜色， 若反应产物变蓝则证明样品中含有阪崎克罗诺杆 菌。 4.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法， 其特征在于， 步骤(2)所述RPA扩增反应 体系为50μL， 包括引物对4.8μL， Buffer  29.5μL， 模板DNA  1μL， 醋酸镁1～3μL， 余量为 ddH2O。 5.根据权利要求4所述的aRPA可视化检测方法， 其特征在于， 所述引物对中上游引物与 下游引物的浓度比为(1～10 0)： 1。 6.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法， 其特征在于， 步骤(2)所述RPA扩增反应 的反应时间为15～3 0min， 反应温度为3 5℃～39℃。 7.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法， 其特征在于， 步骤(3)所述KCl缓冲液的 添加量为50 μL， 浓度为90～120mM 。 8.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法， 其特征在于， 步骤(3)所述氯化血红素 浓度为4.5～5.5 μM 。 9.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法， 其特征在于， 步骤(3)加入氯化血红素 溶液后于37℃孵育10min～20min。 10.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法， 其特征在于， 步骤(3)添加TMB溶液的 量为40 μL， 添加TMB后于 37℃的条件下孵 育20～30min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114561480 A 2一种用于 检测阪崎克罗 诺杆菌的R PA引物对、 试剂盒及检测 方法 技术领域 [0001]本发明涉及一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对、 试剂盒及检测方法， 属于 食品安全技 术领域。 背景技术 [0002]阪崎克罗诺杆菌隶属于克罗诺杆菌属， 是能运动、 周生鞭毛的兼性厌氧革兰氏阴 性菌， 能通过肠上皮层附着并侵入宿主， 引起新生儿或免疫功 能较差的幼儿和老年人致死 性疾病的发生， 如败血症、 脑膜炎和坏死性结肠炎等。 此外， 阪崎克罗诺杆菌传播范围广， 在 乳、 肉、 蔬菜、 水果， 甚至面粉、 即时汤料中都可被检出。 而婴幼儿配方乳粉与阪崎克罗诺杆 菌的检出 联系最为密切， 因此 该菌成为乳粉行业的重点防控 对象。 [0003]目前对于阪崎克罗诺杆菌的检测主要有传统微生物培养法、 免疫学检测以及分子 生物学方法。 国际上采用FDA 颁布的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数 ”方法， 但存在 着耗时长、 检测灵敏度不高以及操作复杂等缺点； 免疫 学方法主要依赖于抗原 抗体反应， 但 是合成抗体价格昂贵， 有些抗原甚至缺少合适的抗体， 造成免疫学方法在快速检测应用中 的限制。 分子生物学检测技术克服了传统和免疫 学检测方法的不足， PCR和LAMP虽然可以实 现特异、 灵敏的检测， 但PCR无法摆脱精密的仪器设备， LAMP也存在着气溶胶污染等问题。 因 此， 迫切需要一种更简单、 经济、 快速的现场检测分析系统。 [0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase  polymerase  amplification， RPA)因其操作简 单， 具有高灵敏、 高选择性， 可兼容多重检测和实现极快 的扩增， 以及可在低 温恒温下操作 等优势引起广泛关注。 该过程无需初始变性步骤和使用较少引物， 是用于目标物快速检测 的一种新型等温扩增技术， 该反应可在短时间内迅速完成、 温度需求低， 已被用于扩增不同 生物体和样本的靶标。 到目前为止， 大多 数RPA产物终点检测大都依赖于琼脂糖凝胶电泳和 侧向流动免疫试纸条。 不对称RPA(aRPA)是通过添加不同浓度比的引物进而实现大量单链 DNA的扩增， 为终点检测带来更多的可能。 [0005]G‑四联体是具有独特化学性质的D NA或RNA序列形成的非典型核酸结构， 该结构 富 含鸟嘌呤(G)。 G ‑四联体/血红素复合物是一种重要的DNA酶， 具有过氧化物酶活性， 可催化 H2O2和3,3,5,5 ‑四甲基联苯胺(TMB)的氧化反应， 并伴有颜色变 化。 DNA酶已被广泛 应用于毒 素和金属离子等小分子的检测 。 然而， 对食源性致病菌的检测 研究较少。 因此， 开发基于G ‑ 四联体的不对称重组酶聚合酶扩增(aRPA)可视化技术在阪崎克罗诺杆菌的现场检测中具 有重要意 义。 发明内容 [0006]为了解决利用传统微生物学方法以及分子生物学方法检测阪崎克罗诺杆菌中存 在的问题， 本发明提供了一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对， 所述RPA引物对基于 阪崎克罗诺杆菌基因设计， 所述RPA引物对中的上游引物核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示，说　明　书 1/8 页 3 CN 114561480 A 3