(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210222664.7 (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 江汉大学 地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技 术 开发区新江大路8号 (72)发明人 陈利红　彭海　方治伟　李论　 周俊飞　高利芬　李甜甜　肖华锋　 万人静　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 刘杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测水稻转基因成分的引物对组合、 试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本申请涉及生物 技术领域， 尤其涉及一种检 测水稻转基因成分的引物对组合、 试剂盒及检测 方法； 所述引物对组合， 核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1至SEQ  ID NO.26所示的引物； 所述引物对组 合的扩增产物可以进行一次高通量测序和分析 即可完成样 本中转基因成分的检测， 避免了传统 基因芯片和数字PCR技术检测多个靶标转基因成 分成本较高的问题， 因此本申请的引物在进行检 测时， 可以通过一次高通量测序和分析， 得到转 基因作物中多个靶标基因或同时检测多种转基 因作物的检测结果， 节省了成本， 便 于推广。 权利要求书1页 说明书11页 序列表5页 附图2页 CN 114774567 A 2022.07.22 CN 114774567 A 1.一种检测水稻转基因成分的引物对组合， 其特 征在于， 所述引物对组合中： 特异性扩增p3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示； 特异性扩增t3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3至SEQ ID NO.4所示； 特异性扩增pNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5至SEQ ID NO.6所示； 特异性扩增tNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； 特异性扩增tPI NII的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9至SEQ  ID NO.10所示； 特异性扩增pZmUBI的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ ID NO.12所示； 特异性扩增pRBCS4的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13至SEQ ID NO.14所示； 特异性扩增tE9的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.15至SEQ ID NO.16所示； 特异性扩增Bar的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17至SEQ  ID NO.18所示； 特异性扩增PAT的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.19至SEQ  ID NO.20所示； 特异性扩增HPT的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.21至SEQ  ID NO.22所示； 特异性扩增GUS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.23至SEQ ID NO.24所示； 和/或， 特异性扩增CrylAb ‑Ac的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.25至SEQ ID NO.26所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括特异性扩增 选自下组的水稻转基因元件的引物对： p35S、 t35S、 pNOS、 tNOS、 tPINII、 pZmUBI、 pRBCS4、 tE9、 Bar、 PAT、 HPT、 GUS和CrylAb ‑Ac； 所述引物对组合包括内参基因S PS的引物对。 3.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述特异性扩增SPS的引物对包括： 第一对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.27至SEQ  ID NO.28所示； 第 二对， 其核苷酸序列如SEQ   ID NO.29至SEQ ID NO.30所示。 4.一种全面检测水稻转基因成分的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1 ‑3 任意一项所述的引物对组合。 5.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括多重PCR预混液。 6.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述引物对组合的对数 范围为13 ‑15对。 7.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括第一容器， 所述第一容 器内含有所述引物对组合。 8.一种如权利要求1 ‑3任意一项所述的引物对组合的用于检测水稻转基因成分的方 法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： 得到待测水稻的DNA和引物对组合； 以所述DNA为模板， 将所述引物对组合加入反应 体系中， 进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通 量测序， 得到高通 量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 得到检测水稻转基因成分的结果。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述高通 量文库的浓度≥2ng/ul。 10.引物对组合的用途， 其特征在于， 用于制备检测试剂盒， 所述检测试剂盒用于检测 水稻转基因的突变位 点和成分； 所述引物对组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.26所示的引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774567 A 2检测水稻转基因成分的引物对组合、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本申请涉及生物技术领域， 尤其涉及一种检测水稻转基因成分的引 物对组合、 试 剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]随着转基因技术在农业产业中的应用， 多种抗虫基因(Cry1Ab,Cry1Ac,Cry1Ab/Ac 等)和抗除草剂基因(BAR,PAT)被用于转基因水稻的研发。 转基因产品在满足人们食用、 利 益需求和提高幸福感的同时， 也由于其技术新、 不成熟、 易在 食物基因改造过程中发生意外 突变等客观原因给人们带来安全隐患和担忧， 因此， 高效、 便捷的转基因食品检测技术显得 至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 Western印迹法、 酶联免疫吸附法(ELISA)、 免疫试纸条和蛋白质芯片等方法是目前主要的 基于蛋白的检测方法。 Western印迹法操作过程复杂， 操作时间较长， 导致该技术无法成为 一种高效的转基因食品检测方法。 ELISA技术也有其缺点， 就是检测通量低， 且1种试剂盒一 般只可检测1种特定的转基因产 物， 检测成本相对较高。 测试纸条法操作简 便， 成本低廉， 且 不需要仪器 设备， 非常适用于现场检测。 但试纸条法检测灵敏度低， 当转基因食品中外源基 因表达量低时， 无法进 行有效检测； 经过加工的转基因食品其蛋白质结构容易受到破坏， 从 而影响检测结果的准确性。 蛋白质芯片技术具有 特异性强、 检测效率高的优点， 但芯片制造 成本相对较高， 固定 于载体表面特异外源蛋白容 易失活， 灵敏度低等。 [0004]目前基于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要 包括普通定性PCR、 巢式PCR、 环介导等温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相 对于普通定性P CR方法， 巢式P CR高了检测的灵敏度， 然而它们的检测效率均较低， 尤其检测 多基因对象时更加费时费力。 LAMP不需要热循环， 为等 温扩增， 扩增效率可达到109～1010数 量级， 具有操作简单、 特异性强、 等温灵敏、 产物易检测等优点； 缺点是引物设计较为复杂， 对扩增产物处理不当容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复性好、 灵敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 多重P CR方法可以 在一个反应中同时检测多个基因， 但常规的电泳检测结果很难判断， 容易出现假阳性和假 阴性结果。 基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通量、 灵敏度高、 特异 性强等优点， 且可平行检测1个转基因作 物中多个基因或同时检测多种转基 因作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些 因素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0005]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决的关键 问题。 发明内容 [0006]本申请提供了一种检测水稻转基因成分的引 物对组合、 试剂盒及检测方法， 以解说　明　书 1/11 页 3 CN 114774567 A 3