(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210209164.X (22)申请日 2022.03.04 (71)申请人 中国林业科 学研究院木材工业研究 所 地址 100091 北京市海淀区香 山路东小 府1 号 (72)发明人 焦立超　陆杨　殷亚方　郭雨　 王杰　郭娟　何拓　马灵玉　 姜笑梅　张永刚　 (74)专利代理 机构 北京和信华成知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11390 专利代理师 焦海峰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种DNA条形码及鉴别楠属和润楠属中多种 木材的方法 (57)摘要 本发明公开了一种DNA条形码及鉴别楠属和 润楠属中多种木材的方法， 包括基于质体基因组 序列rps16 ‑psbI、 psbE ‑petG、 rps8 ‑rpl16、 rpl23‑ycf2、 ndhF ‑ccsA和ycf1中的任意2种以上 或全部组合形成的DNA条形码； 以及如下步骤： S100、 将木材样品在低温环境中研磨， 以制得木 粉样品； S2 00、 提取木粉样品中的DNA样品； S300、 以DNA样品为模板， 使用PCR扩增质体基因组序列 中的ycf1、 rps16 ‑psbI和rps8 ‑rpl16条形码序 列， 以得到扩增产物； S400、 对扩增产物进行测 序， 得到ycf1、 rps16 ‑psbI和rps8 ‑rpl16序列， 组 合， 以制得ycf1+rps16 ‑psbI+rps8 ‑rpl16组合条 形码； S500、 采用ycf1+rps16 ‑psbI+rps8 ‑rpl16 组合条形码， 并基于Tax onDNA法和系统发育进 化 树法来鉴别楠属和润楠属中的多种木材。 发明的 DNA条形码， 具有更丰富的序列信息位点， 进而 提 高物种鉴别 能力； 且此方法识别准确度高， 取样量少， 适用于高值木制品微损鉴定 。 权利要求书2页 说明书10页 序列表61页 附图3页 CN 114540532 A 2022.05.27 CN 114540532 A 1.一种DNA条形码， 其特征在于， 包括基于质体基因组序列rps16 ‑psbI、 psbE ‑petG、 rps8‑rpl16、 rpl23 ‑ycf2、 ndhF ‑ccsA和ycf1中的任意2种以上或全部组合形成的DNA条形 码， 所述DNA条 形码用于鉴别楠属 和润楠属中多种木材。 2.根据权利要求1所述的一种DNA条形码， 其特征在于， 还包括ycf1+rps16 ‑psbI+rps8 ‑ rpl16组合条形码， 所述ycf1+rps16 ‑psbI+rps8 ‑rpl16组合条形码参照SEQ  ID No.1‑45所 示。 3.根据权利要求2所述的一种DNA条形码， 其特征在于， 多种所述楠属和润楠属木材分 别为闽楠Phoebe  bournei、 浙江楠P.chekiangensis、 白楠P.neurantha、 竹叶楠 P.omeiensis、 紫楠P.sheareri、 楠木P.zhennan、 锈毛润楠Machilus  balansae、 华东楠 M.leptophyl la、 刨花楠M.pauho i、 红楠M.thunbergi i及滇润楠M.yun nanensis。 4.一种鉴别楠属 和润楠属中多种木材的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S100、 将木材样品在 ‑196℃低温环境中研磨， 以制得木粉样品； S200、 提取所述木粉样品中的DNA样品； S300、 以所述DNA样品为模板， 使用PCR扩增质体基因组序列中的ycf1、 rps16 ‑psbI和 rps8‑rpl16条形码序列， 以得到扩增产物； S400、 对所述扩增产物进行测序， 得到所述ycf1、 所述rps16 ‑psbI和所述rps8 ‑rpl16序 列， 并对其进行组合， 以制得 所述ycf1+rps16 ‑psbI+rps8 ‑rpl16组合条 形码； S500、 采用所述ycf1+rps16 ‑psbI+rps8 ‑rpl16组合条形码， 并基于TaxonDNA法和系统 发育进化 树法来鉴别楠属 和润楠属中的多种木材。 5.根据权利要求4所述的一种鉴别楠属和润楠属中多种木材的方法， 其特征在于， 在步 骤S100中， 还包括以下步骤： S101、 使用无菌手术刀将木材切为短木片状， 将其置于无菌50％乙醇中浸泡1h后气干 处理， 以制得气干样本； S102、 将所述气干样本与质量比为0.5 ‑1的交联聚乙烯吡咯烷酮粉末加入到冷冻研磨 管中， 在‑196℃低温环境中混合并研磨， 以制得研磨粉； S103、 将所述研磨粉过5 0～200目筛， 以制得 所述木粉样品； S104、 将所述木粉样品放入至灭菌 离心管内进行分装保存。 6.根据权利要求4所述的一种鉴别楠属和润楠属中多种木材的方法， 其特征在于， 在步 骤S200中， 还包括以下步骤： S201、 向所述木粉样品加入漂洗液， 进行第一次混合， 所述漂洗液对所述木粉样品的楠 属/润楠属木质部次生代谢物进 行漂洗处理， 并在混合均匀 后采用离心机以3000～6000g离 心处理10‑15min， 弃去上层清液， 以制得第一漂洗粉末； S202、 向所述第一漂洗粉末加入所述漂洗液， 进行第二次混合， 并重 复步骤S201中的离 心过程， 以制得第二漂洗粉末； S203、 对所述第二漂洗粉末进行DNA提取， 并对提取的所述DNA进行纯化， 以制得所述 DNA样品； 其中， 所述第一次混合和所述第二次混合的混合时间均为10mi n； 所述漂洗液包括： 100～300mM且pH为8.0的Tris ‑HCl， 10～30mM且pH为8.0EDTA， 1～4％ (w/v)PVP ‑40， 5％(v/v)甘油， 5～10％(w/v)PEG80 00以及300～500mM山梨醇；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114540532 A 2所述漂洗液在使用前加入1～ 2％(v/v)β ‑巯基乙醇。 7.根据权利要求4所述的一种鉴别楠属和润楠属中多种木材的方法， 其特征在于， 在步 骤S300中， 所述PCR扩增的反应体系为0.5～3U  DNA聚合酶、 1.0～2.0mM  MgCl2、 200μM单一dNTP、 0.1～5.0 μM单一引物、 pH7.0～8.0的0.1～1.5mg/mL牛 血清白蛋白和10～10 00ng模板DNA； 所述PCR扩增的反应程序如下： 94～96℃预变性0.5～10min； 94～96℃变性0.05～ 2min， 40～65℃退火0.5～2min， 72℃延伸0.3～2min， 并循环20～50次； 72℃终延伸2～ 15min； 其中， 扩增ycf1序列的正反引物参照SEQ  ID No.46‑51所示， 扩增rps16 ‑psbI序列的正 反引物参照SEQ  ID No.52‑55， 扩增rps8 ‑rpl16序列的正反引物参照SEQ  ID No.56‑59所 示。 8.根据权利要求4所述的一种鉴别楠属和润楠属中多种木材的方法， 其特征在于， 在步 骤S500中； 所述Taxo nDNA法基于best  close match指标判别； 所述系统发育进化 树法基于邻接法鉴别。 9.根据权利要求4所述的一种鉴别楠属和润楠属中多种木材的方法， 其特征在于， 其指 标基于核苷酸多态性(nucleotide  diversity,Pi)、 DNA片段获取成功率、 片段长度及鉴别 能力4项指标的结合应用。 10.根据权利要求9所述的一种鉴别楠属和润楠属中多种木材的方法， 其特征在于， 所 述核苷酸多态性(Pi)指标， 是基于质体全基因 组序列比对 且Pi＞0.0 03； 所述DNA片段获取成功率≥70％； 所述片段长度为15 0～500bp； 所述鉴别能力是基于所述Taxo nDNA法和所述系统进化 树法判别。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114540532 A 3