(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210224009.5 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 四川农业大 学 地址 611130 四川省成 都市温江区惠民路 211号 (72)发明人 赵俊茗　马啸　杨建　雷雄　 董志晓　 (74)专利代理 机构 成都点睛专利代理事务所 (普通合伙) 51232 专利代理师 李玉兴 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因及其 应用 (57)摘要 本发明公开了提供一种在黑药仲彬草干旱、 高温和低温处理下均能够稳定表达的黑药仲彬 草实时荧光定量PCR内参基因。 该内参基因比以 往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好, 稳定性高等优点,同时该内参基因在黑药仲彬草 干旱、 高温和低温处理条件下均具有稳定的表达 水平， 而现有的内参基因均无法实现在黑药仲彬 草干旱、 高温和低温处理条件下均具有稳定的表 达水平， 因此， 本发明所属的内参基因比现有的 通用内参基因具有更好的校正能力， 填补了黑药 仲彬草研究领域中缺少合适的、 通用的荧光定量 PCR内参基因的空白,为今后黑药仲彬草以及其 他小麦族植物基因表达分析、 筛选、 验证工作提 供了有效的内参基因校正工具。 适合在内参基因 领域推广运用。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图11页 CN 115044693 A 2022.09.13 CN 115044693 A 1.黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因， 其特征在于： 所述内参基因为Transcript ‑ 28482； 所述Transcript ‑28482内参基因的cDNA序列如序列表SEQUENC E ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因在黑药仲彬草干旱、 高 温和低温处 理后基因表达分析中的应用。 3.利用权利要求1所述的黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因在黑药仲彬草干旱、 高 温和低温处 理后基因表达分析 方法， 包括如下步骤： 1)材料培养与处理： 选取黑药仲彬草种子， 经1％次氯酸钠消毒， 无菌蒸馏水冲洗5遍 后， 将种子播于20 ×15×5cm塑料盆中， 每盆1.5g， 用石英砂覆盖， 浇注1/2倍的霍格兰营养 液， 在昼夜温度分别为23℃和19℃、 光周期12h、 相对湿度75％、 光照强度250u mol·m‑2·s‑1 的生长室中培养21天后， 将黑药仲彬草植株分成三个处理组， 将三个处理组的植株分别置 于4℃的培养箱中进 行冷胁迫、 置于白天38 /晚上33℃的培养箱中进行高温处理以及用20％ 浓度的PEG ‑6000进行干旱胁 迫， 分别在每个处理开始后0小时、 12小时、 24小时、 48小时和96 小时采集叶片样品， 采集的样品立即在液氮中冷冻， 并储 存于‑80℃的冰箱用于RNA的提取； 2)、 黑药仲彬草总RNA的提取： 采用RNA提取试剂盒提取总RNA， 1％琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性， 并使用Nan oDrop对提取的RNA进行 纯度检测以及浓度的定量； 3)、 cDNA的合成： 合格样品采用Evo  M‑MLVRTMix试剂盒合成cDNA， 储存于 ‑20℃备用； cDNA的合成的具体步骤如下： 首先， 在PCR管中配制反应液总量为20uL， 反应过程如下： 先在37℃下反应15min后， 再 85℃反应5s， 之后保持在4℃； 所述反转录反应液体系如表1所示: 表1 反转录反应液体系 4)、 目标基因和内参基因的qRT ‑PCR反应： 使用2×SYBR Green Pro Taq HS Premix进行qRT ‑PCR， 将内参基 因和目标基因点在同 一块PCR板上， 反应在CFX96TM Real Time System荧光定量仪上进行， 所述PCR反应体系如表 2所示： 表2 PCR反应体系 扩增程序为： 95℃预变性30s； 95℃ 变性5s， 60℃退火30s， 40个循环， 然后 进行65～95℃ 溶解曲线分析， 每个循环增加0.5℃， 持续2 ‑5s获得解链温度， 采集溶解曲线荧光信号， Ct值 数据由CF X96TM Real Time System荧 光定量PCR仪自动读取；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044693 A 25)、 将获得的Ct值用2‑△ △Ct法计算相对表达量,具体步骤如下： △Ct＝Ct(目标基因) ‑Ct(内参基因) △△Ct＝△Ct(处理)‑△Ct(对照) 2‑△ △Ct＝相对表达量。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044693 A 3