(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210217167.8 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长 春市前进大街269 9 号 (72)发明人 宫鹏涛　王金红　曹松高　张西臣　 李建华　曹利利　赵盼盼　王晓岑　 李新　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 专利代理师 孙伟新 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂盒及检 测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于RPA的弓形虫核酸检 测试剂盒及检测方法， 试剂盒中包含： 含RPA冻干 颗粒的反应管、 反应缓冲液、 醋酸镁以及ddH2O； 本发明是根据通过参考 GenBank中弓形虫B1基因 序列， 选择特异性保守区域， 设计大量RPA引物和 探针， 从中筛选出一套可快速有效检测出弓形虫 B1基因的引物及探针组合， 并通过建立实时荧光 RPA方法， 为样品中弓形虫的快速现场检测提供 了有效的技术手段， 尤其适用于实验设备较为落 后的基层检测实验室和疫情突发现场。 本发明的 引物和探针特异性强， 仅对弓形虫有特异性扩增 曲线， 而其它寄生虫、 细菌、 病毒均无扩增曲线， 灵敏度高， 检出限为102拷贝数/ul。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 114717346 A 2022.07.08 CN 114717346 A 1.一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂盒， 其特征在于： 试剂盒中包含： 含RPA冻干颗粒 的反应管、 反应缓冲液、 醋酸镁以及ddH2O； 由于B1基因在检测弓形虫时具有特异性和 敏感 性双高的特点， 作为靶基因设计一对引物及一条探针， 引物对和探针如下： 上游引物： 5' ‑ACATTCCAGCAACTTCTGCCTTTGTTCTTT‑3' 下游引物： 5' ‑ATACAGAAAATTAAGCGACCAACCTTGTCC‑3' 探针： 5'‑AGCCAACCCAGCAAACACCGACGAACTCTC[FAM ‑dT][THF][BHQ1 ‑dT]AGAGTAACAAAGAGA ‑ [C3‑Spacer]‑3'； 探针序列中相关T碱基被dT ‑FAM和dT‑BHQ1取代， G碱基(距5'端至少30bp、 距3'端至少 15bp)被[THF]残基取代， 3'端由C 3‑Spacer修饰。 2.根据权利要求1所述的一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂盒， 其特征在于： 所述上 游引物、 下游引物和探针在RPA试剂盒中的终浓度为10 μM 。 3.根据权利要求1所述的一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂盒， 其特征在于： 所述试 剂盒的25 μL反应体系如下： 14.75 μL的反应缓冲液， 10 μM上下游引物各1.05 μL， 10 μM探针0.3 μL， ddH2O 5.6 μL， 弓形 虫DNA模板1 μL及1.25 μL  280mmol/L的醋酸镁溶 液。 4.根据权利要求1所述的一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂盒， 其特征在于： 所述试 剂盒应用不以疾病的诊断和治疗为目的。 5.根据权利要求1所述的一种基于RPA的弓形虫核酸检测方法， 其特征在于： 包括如下 步骤： 以待检测DNA 为模板， 采用所述试剂盒进行重组酶聚合 酶扩增， 对扩增结果进 行分析： 荧光曲线明显上升的则含有弓形 虫基因组DNA， 反 之则不含有弓形 虫基因组DNA。 6.根据权利要求5所述的一种基于RPA的弓形虫核酸检测方法， 其特征在于： 所述重组 酶聚合酶扩增时， 反应温度为39℃， 反应时间为20mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717346 A 2一种基于R PA的弓形虫核酸检测试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体为一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂盒及检测 方法。 背景技术 [0002]弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasm a gondii)引起的一种重要的人兽共患寄生 虫病， 该病 呈世界性范围分布， 病原可以感染包括哺乳动物及鸟类在内的几乎所有的温血 动物。 据调查， 目前全世界约有1/3的人口感染弓形虫病， 欧洲及美洲国家的感染率高达50 ‑ 80％， 我国不同地区人群弓形虫的感染率不同， 平均可达7.88 ％。 弓形虫呈机会性致病， 欧 美国家感染率高是因普遍喜食未煮熟的肉类， 致使弓形 虫病感染率普遍高于其 他地区。 [0003]免疫功能正常的人感染弓形虫后一般无症状， 或者表现为一过性轻微症状。 对于 免疫功能障碍患者， 如艾滋病人， 弓形虫的感染可引起一系列严重的症状， 包括弓形虫肺 炎、 心肌炎、 脑炎等， 严重危及患者生命。 在怀孕期间感染弓形虫， 可引起胎儿流产， 死胎或 者出生后留下后遗症。 目前， 针对这种病原还没有特效的治疗药物， 所以对于它的预防、 检 测方法的建立 就显得尤为重要。 [0004]目前弓形虫诊断主要有病原形态学、 免疫学及分子生物学等检查方法。 病原生态 学方法得对病原进行分离鉴定， 费时费力， 对人员操作要求高。 血清学方法具有灵敏度低、 特异性差、 结果判断主观性强和不适合大批量检测等特点， 限制 了它们在临床 中的广泛应 用。 因此， 选择用分子生物学检测手段不失为一种准确和便捷的好方法。 目前， 传统的聚合 酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR(real ‑time PCR)是应用最多的分子诊断方法， 但是这 两种技术都需要熟练的操作人员， 费时费力， 难以现场进行操作和向基层推广。 [0005]重组酶聚合酶扩增(Recombinase  polymerase  amplification  RPA)是近年来发 展起来的一种快速诊断不同病原的方法， 已广泛用于病毒、 细菌、 寄生虫诊断中。 RPA利用重 组酶蛋白与引物形成复合物， 该复合物促进引物与双链RNA的同源靶序列的结合， 聚合酶进 行后续的合 成， 整个过程仅需在37 ‑42℃下反应20 ‑30分钟即可。 与普通P CR方法与荧光定量 PCR方法相比， 整个过程不需要高温变性和低温退火步骤， 操作简单， 时间较 短。 特别适用于 体外诊断、 兽医、 食品安全、 生物 安全、 农业等领域， 目前已经被广泛应用于多种寄生虫的快 速检测， 但尚未见用于弓形虫的荧光RPA的检测 。 为此提供了一种基于RPA的弓形虫核酸检 测试剂盒及检测方法。 发明内容 [0006]本发明的目的是针对现有技术的缺陷， 提供一种基于RPA的弓形虫核酸检测试剂 盒及检测方法， 以解决上述背景技 术提出的问题。 [0007]为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 一种基于 RPA的弓形虫核酸检测试剂 盒， 试剂盒中包含： 含 RPA冻干颗粒的反应管、 反应缓冲液、 醋酸镁以及ddH2O； 由于B1基 因在 检测弓形虫时具有特异性和敏感性双高的特点， 作为靶基因设计一对引物及一条探针， 引说　明　书 1/5 页 3 CN 114717346 A 3