(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210213857.6 (22)申请日 2022.03.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114317781 A (43)申请公布日 2022.04.12 (73)专利权人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 冯春刚　段颖　史凯　鹿西学　 刘相平　李东锋　赵茜　宋迟　 徐善金　 (74)专利代理 机构 南京乐羽知行专利代理事务 所(普通合伙) 32326 专利代理师 朱磊　孙承尧 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 Ulrika Gunnarsson等.Mutati ons in SLC45A2 Cause Pluma ge Color Variati on in Chicken and Japanese Quai l. 《Genetics》 .2007,第867-87 7页. 审查员 季璇馨 (54)发明名称 一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其 应用 (57)摘要 本发明涉及一种分子标记及应用， 尤其涉及 一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用， 属于生物 技术领域。 本发明提供了鉴定鸽长短绒 性状相关的SNP标记引物对， 并提供了用其检测 鸽子长短绒性状的分子方法。 本发明所述的SNP 标记位点为鸽参考基因组版本Cliv_1.0的Z染色 体769369bp位点的核苷酸， 且具有A /G多态性。 所 述SNP标记与长短绒性状高度关联， 该单核苷酸 多态性可以作为鸽子育种的遗传标记， 利用分子 生物学手段， 进行标记辅助选择， 具有重要的育 种价值和经济价 值。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 114317781 B 2022.06.10 CN 114317781 B 1.一种与鸽长短绒性状相关的分子标记的特异性引物对， 其特征在于： 分子标记所需 鸽子DNA特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO： 2所示， 所述分子标记的 核苷酸序列如SEQ ID NO： 3或SEQ ID NO： 4所示。 2.一种与鸽长短绒性状相关的分子标记的应用， 其特征在于： 用于鉴别鸽子的长短绒 性状位点基因型， 包括以下步骤： 步骤一、 用鸽子DNA特异性引物对鸽子DNA样品进行PCR扩增， 得到扩增产物； 鸽子DNA特 异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO： 2所示， 所述分子标记的核苷 酸序列 如SEQ ID NO： 3或SEQ ID NO： 4所示， PCR扩增产物长度为429bp， 包含鸽子Z染色体的 769369bp位点； PCR扩增的反应 体系以50 μl计， 待测鸽子DNA 5 0 ng， Accurate Taq DNA 聚合酶 1.25 IU， 含Mg2+的10X PCR反应缓冲液 5 μl， 10mM dNTPs 1 μl， 10 μM 上游引物F 1 μl， 10 μM 下游引物R 1 μl， 无菌水 补足至 50 μl； PCR扩增的反应条件为： 94℃预变性5min； 94℃变性30sec， 58℃退火30sec， 72℃延伸 60sec， 共30循环； 72℃延伸5min； 20℃ 保存； 取10 μl用于琼脂糖凝胶电泳检测， 扩增到单一 目的条带后进行 下一步酶切； 步骤二、 在所述扩增产物中加入限制性内切酶， 得到酶切产物； 限制性核酸内切酶选用 TSP45I内切酶； 酶切反应 体系以20 μl计， PCR产物 10 μl， 10X NEB缓冲液 2 μl， TSP45I内切酶 10 IU， 无菌水 补足至20 μl， 反应条件为6 5℃， 1h； 步骤三、 将所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 得到检测结果； 步骤四、 依据所述检测结果判断酶切产物的条带数目和条带大小， 鉴定待测鸽子的长 短绒性状位点基因型， 鉴定标准是， 待测样品的酶切产 物显示一条条带， 大小为429bp， 则待 测样品为短绒纯合基因型； 待测样品的酶切产 物显示两条条带， 大小为166bp和263bp， 则待 测样品为长绒纯合基因型； 待测样品的酶切产物显示三条条带， 大小为166bp、 263bp和 429bp， 则待测样品为长绒杂合基因型。 3.根据权利要求2所述与鸽长短绒性状相关的分子标记的应用， 其特征在于： 所述步骤 三中， 琼脂糖凝胶电泳检测结果中的三条条带分别对应长度为166bp、 263bp的酶切产物和 长度为429bp的原始PCR产物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317781 B 2一种与鸽长短绒性状相关的分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种分子标记及应用， 尤其涉及一种与鸽长短绒性状相关的分子标记 及其应用， 属于生物技 术领域。 背景技术 [0002]单核苷酸多态性 （SNP） ， 是指在 基因组上单个核苷酸的变异， 在遗传物质传递过程 中可以稳定 遗传给后代， 可以作为分子标记进行育种和保种。 [0003]鸽子是我国仅次于鸡鸭鹅的第四大家禽， 但是和鸡相比， 鸽子 的遗传学和基因组 学研究进展较为缓慢。 羽毛是禽类所特有的表皮衍生物， 具有保温、 飞翔等功能。 羽毛具有 不同的颜色、 性状等变异， 是遗传学和发育学研究的重要模型。 羽毛类型十分丰富， 绒羽是 羽毛的一种类型， 具有保温和护体等作用， 是一种优良的热绝缘体和调料。 绒羽又分为雏绒 羽、 体绒羽和粉绒羽， 其中雏绒羽存在于大部 分鸟类的雏形阶段。 鸽子的长 短绒性状是指鸽 子在出壳后大约1 ‑7天， 其表皮的雏绒羽 （natal  down） 的长短以及疏密程度。 大部分野生型 的鸽子出壳后表皮被大约1c m长的绒毛紧密覆盖， 命名为野生型绒毛或者长绒毛， 而携带某 些突变基因的鸽子出壳后绒毛很 短， 命名为短绒毛。 全身大部 分， 尤其是头部区域绒毛短且 稀疏， 肉眼可以直接区分开， 但是该表型只有雏鸽出壳后七天之内能够准确判断， 之后随着 雏绒羽的生长， 长绒和短绒个体之间难以区分。 20世纪40年代， 人们 通过杂交试验发现， 鸽 子短绒表型符合伴性隐性遗传规律， 但是关于该性状的natal ‑down基因和分子标记的研究 尚未见报道。 该性状作为一种伴性遗传的性状， 有望在鸽的雌雄自别技术的研究开发中发 挥重要作用。 如果要将该性状运用到育种工作中， 则需要利用分子标记来准确 鉴定鸽子的 长短绒位点的基因型， 但是目前尚缺少鸽子的长短绒 性状的分子标记及其检测方法。 发明内容 [0004]本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷， 提出一种与鸽长短绒性状相关的分子 标记及其应用， 为检测鸽子 长短绒性状基因型提供新的途径。 [0005]本发明首先提供一种与鸽长短绒性状相关的分子标记， 所述分子标记的核苷酸序 列如SEQ ID NO： 3或SEQ  ID NO： 4所示。 两个核苷酸序列的长度为429bp， 包含鸽子Z染色体 的769369bp位点。 [0006]本发明进一步提供分子标记所需鸽子DNA特异性引物对， 上游引物F： 5 ’‑ GATGCTGAG GCCTTTCATGT‑3’  （如SEQ ID NO： 1所示） ， [0007]下游引物R： 5 ’ ‑TTTCCCCAAAGATCCAACAG‑3’  （如SEQ ID NO： 2所示） 。 [0008]本发明再进一步提供一种与鸽长短绒性状相关的分子标记的应用， 主要是利用鸽 Z染色体的769369bp位点 （参考基因组版本Cliv_1.0） 的一个核苷酸进行单核苷酸多态性 （SNP） 检测， 根据检测结果判 定鸽的长短绒基因 （natal ‑down基因） 的基因型以及该基因是 否纯合。 具体的方法包括以下步骤： [0009]步骤一、 用鸽子DNA特异性引物对鸽子DNA样品进行PCR扩增， 得到扩增产物；说　明　书 1/4 页 3 CN 114317781 B 3