(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210217123.5 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 宁波美康盛 德医学检验所有限公司 地址 315105 浙江省宁波市 鄞州区启明南 路269号 (72)发明人 邹继华　王石　林有升　丁瑜　 邹玄　刘晓光　 (74)专利代理 机构 宁波市甬远专利代理有限公 司 33409 专利代理师 沈春红 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种多重PCR特异性基因检测引物组、 试剂 盒、 方法和应用 (57)摘要 一种多重PCR特异性基因检测引物组、 试剂 盒、 方法和应用， 可 以用于检测心脑血管疾病药 物基因多态性位点； 包括55对特异性引物， 分成 两个Pool， Pool ‑1包含23对引物， 核酸序列如SEQ   ID NO:1‑46所示； Pool ‑2包含32对引物， 核酸序 列如SEQ IDNO:47‑110所示； 本申请的技术方案 具有能用于心脑血管疾病药物用药基因检测， 降 低药物副作用、 预判药物疗效， 精准药物剂量使 用的优点。 权利要求书5页 说明书17页 序列表18页 附图1页 CN 114703261 A 2022.07.05 CN 114703261 A 1.一种多重PCR特异性基因检测引物组， 其特征在于： 包括55对特异性引物， 分成两个 Pool， Pool ‑1包含23对引物， 核酸序列如SEQ  ID NO:1‑46所示； Pool ‑2包含32对引物， 核酸 序列如SEQ  ID NO:47‑110所示。 2.根据权利要求1所述的多重PCR特异性基因检测引物组， 其特征在于： 所述的55对特 异性引物， 其中： 核酸序列为SEQ  ID NO:1‑2的引物对对应VKORC1基因； 核酸序列为SEQ  ID  NO:3‑4的引物对对应CYP3A5基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:5‑6的引物对对应ABCC8基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:7‑8的引物对对应APOE基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:9‑10的引物对对 应DOT1L基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:11‑12的引物对对应LTC4S基因； 核酸序列为SEQ  ID  NO:13‑14的引物对对应ALDH2 基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:15‑16的引物对对应APOA 5基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:17‑18的引物对对应GP1BA基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:19‑20的引 物对对应GNB3基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:21‑22的引物对对应KCNJ11基因； 核酸序列为 SEQ ID NO:23‑24的引物对对应AGTR1基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:25‑26的引物对对应 NPPA基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:27‑28的引物对对应CYP2C19基因； 核酸序列为SEQ  ID  NO:29‑30的引物对对应ADD1基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:31‑32的引物对对应CETP基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:33‑34的引物对对应COQ2 基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:35‑36的引物对 对应APOE基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:37‑38的引物对对应CYP2C19基因； 核酸序列为SEQ   ID NO:39‑40的引物对对应NEDD4L基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:41‑42的引物对对应 SLCO1B1基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:43‑44的引物对对应SLC22A2基因； 核 酸序列为SEQ  ID  NO:45‑46的引物对对应SLCO1B1基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:47‑48的引物对对应KCNIP1基 因； 核酸序列为SEQ  ID NO:49‑50的引物对对应SLC22A1基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:51‑52 的引物对对应ABCG2基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:53‑54的引物对对应CYP4F2基因； 核酸序 列为SEQ ID NO:55‑56的引物对对应KIF6基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:57‑58的引物对对应 ABCB1基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:59‑60的引物对对应ABCB1基因； 核酸序列为SEQ  ID NO: 61‑62的引物对对应MTRR基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:63‑64的引物对对应PPAGR基因； 核 酸 序列为SEQ  ID NO:65‑66的引物对对应ADRB1基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:67‑68的引物对 对应MTHF R基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:69‑70的引物对对应MTHF R基因； 核 酸序列为SEQ  ID  NO:71‑72的引物对对应NAT2 基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:73‑74的引物对对应NAT2 基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:75‑76的引物对对应NAT2 基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:77‑78的引物对 对应CYP2C9基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:79‑80的引物对对应ACE基因； 核酸序列为SEQ  ID  NO:81‑82的引物对对应PRKCA 基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:83‑84的引物对对应KCNK3基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:85‑86的引物对对应CYP2C19基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:87‑88的 引物对对应NAT2基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:89‑90的引物对对应GPIa基因； 核酸序列为 SEQ ID NO:91‑92的引物对对应C11ORF65基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:93‑94的引物对对应 NOS1AP基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:95‑96的引物对对应CYP2D6基因； 核酸序列为SEQ  ID  NO:97‑98的引物对对应GPIa基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:99‑100的引物对对应CYP2C9基 因； 核酸序列为SEQ  ID NO:101‑102的引物对对应N OS1AP基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:103‑ 104的引物对对应ABCB1基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:105‑106的引物对对应AD RB2基因； 核 酸序列为SEQ  ID NO:107‑108的引物对对应NAT2 基因； 核酸序列为SEQ  ID NO:109‑110的引 物对对应COX‑1基因。权　利　要　求　书 1/5 页 2 CN 114703261 A 23.根据权利要求1所述的多重PCR特异性基因检测引物组， 其特征在于： 所述的引物组 在引物设计时， 每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度， 扩增产物长度在200 ‑300bp之 间。 4.一种基于多重PCR及高通量测序技术检测个体化用药相关基因位点多态性的试剂 盒， 其特征在于： 所述的试剂盒包括所述的核酸序列为SEQ  ID NO:1‑110的55对特异性引物 中的至少一对。 5.根据权利要求4所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测个体化用药相关基因位 点多态性的试剂盒， 其特征在于： 所述的试剂盒包括核酸序列为SEQ  ID NO:1‑110的、 55对 特异性引物、 I ndex、 酶混合物、 PCR  Enhancer和无核酸酶水。 6.根据权利要求5所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测个体化用药相关基因位 点多态性的试剂盒， 其特 征在于： 所述的试剂盒具体的组分如下： 7.一种基于多重PCR及高通量测序技术检测基因多态性位点的方法， 其特征在于： 包括 以下步骤： (1)待检测样本的核酸 提取及质控； (2)用核苷酸序列为SEQ  ID NO:1‑110的55对特异性引物中的至少一对， 对所提取的 DNA的目标区域进行PCR扩增， 备用； (3)使用磁珠法对PCR扩增产物进行纯化， 将纯化后的扩增子文库使用Fluorometer   Qubit进行浓度测定， 记录文库浓度， 并将pool ‑1和pool‑2的纯化产物等质量混合， 得到文 库； 然后对文库进行片段长度测定， 若片段长度主要分布在300 ‑500bp， 主峰在380 ±10bp， 质检合格， 定量混样， 上机测序； 若长度分布超出300 ‑500bp， 或者主峰不在380 ±10bp之间， 重复建库并质检若再次不合格， 检测中止， 空 白质控组应为不合格， 否则代表有核酸污染， 无需测序上机 。 8.根据权利要求7所述的基于多重PCR及高通量测序技术检测基因多态性位点的方法， 其特征在于： 所述的PCR扩增采用的PCR反应 体系为：权　利　要　求　书 2/5 页 3 CN 114703261 A 3