(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221021693 6.2 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 内蒙古农业大 学 地址 010020 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区鄂尔多斯大街内蒙古农业大学新 校区 (72)发明人 张笑宇　冯亚艳　张冬梅　霍宏丽　 李乐乐　李得宙　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 崔自京 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/82(2018.01) A01N 37/46(2006.01) A01N 47/44(2006.01) A01N 57/16(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) (54)发明名称 一种诱导马铃薯黑痣病抗性基因StZFP2及 其应用 (57)摘要 本发明提供了一种马铃薯诱导抗病基因 StZFP2， 其为锌指蛋白基因， 所述基因受硅酸钠 诱导， 属于基因工程技术领域。 施加硅酸钠的马 铃薯幼苗， 锌指蛋白基因StZFP2显著上调表达， 将该基因克隆并转入马铃薯脱毒组培苗中， 接种 马铃薯黑痣病病原菌(Rhizcotonia  solani)， 过 表达锌指蛋白基因StZFP2 的植株抗病能力 明显 增强， 清除活性氧的能力也优于野生型马铃薯， 表明本发明提供的锌指蛋白基因StZFP2能提高 马铃薯对黑 痣病菌的抗 性。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 114561399 A 2022.05.31 CN 114561399 A 1.一种马铃薯诱导抗病基因StZFP2， 其特征在于， 所述基因为锌指蛋白基因， 受硅酸钠 诱导， 该基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述的马铃薯诱 导抗病基因StZFP2在马铃薯抗 黑痣病中的应用； 优选的， 所述马铃薯诱 导抗病基因StZFP2的表达受硅酸钠诱 导。 3.如权利 要求1所述的马铃薯诱导抗病基因StZFP2， 其特征在于， 该基因编码蛋白的氨 基酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 4.一种生物材 料， 其特征在于， 为下述(1) ‑(3)中的至少一种； (1)含有所述锌指蛋白基因StZFP2核酸分子的表达盒； (2)含有(1)所述表达盒的核酸分子的重组载体； (3)含有(1)所述表达盒的核酸分子的重组微生物或含有(2)所述重组载体的重组微生 物。 5.如权利要求4所述的生物材料， 其特征在于， (1)中， 所述表达盒包括锌指蛋白基因 StZFP2核酸分子和标记元件； 优选的， 所述标记元件为 光标记元件； 更优选的， 所述 光标记元件为GFP。 6.如权利要求4所述的生物材料， 其特征在于， (2)中， 所述含有(1)所述表达盒的核酸 分子的重组载体为pCAMBIA13 02‑StZFP2； 优选的， 所述重组表达载体为pCAMBIA13 02‑35S‑StZFP2。 7.如权利要求4所述的生物材料， 其特征在于， (3)中， 所述含有(1)所述表达盒的核酸 分子的重组微生物或含有(2)所述重组载体的重组微生物为克隆菌株、 穿梭菌株和工程菌 株的一种或多种； 优选的， 所述克隆菌株为DH 5α； 优选的， 所述 穿梭菌株为农杆菌 。 8.一种锌指蛋白基因StZFP2的克隆装置， 其特 征在于， 包括扩增引物： T‑StZFP2‑F： 5’ ‑ATGAGTGC CTTAAAAAGAAGCAGAG‑3’； T‑StZFP2‑R： 5’ ‑AATAAAAATTCTCAAAACAGGAGAT‑3’； 优选的， 还 包括聚合酶链式反应的必要元 素中的一种或多种； 优选的， 所述聚合酶链式反应的必要元素为dNTP、 反应 缓冲液、 DNA聚合酶或Mg2+中的一 种或多种。 9.如权利要求8所述的克隆装置的使用方法， 其特征在于， 反应条件为： 94℃预变性 5min； 94℃变性3 0s， 55℃退火1mi n， 72℃延伸3 0s， 35个循环， 最后72℃运行10mi n。 10.如权利要求1所述的基因、 权利要求2所述的应用、 权利要求3所述的蛋白、 权利要求 4‑7所述的生物材料、 权利要求8所述克隆装置和 权利要求9所述的方法在提高马铃薯清除 活性氧能力、 抗 黑痣病中的应用； 优选的， 所述 黑痣病马铃薯黑 痣病； 优选的， 如上 所述的应用， 包括以下步骤： 将所述锌指蛋白基因StZFP2过表达载体转入大西洋马铃薯； 优选的， 所述锌指蛋白基因StZFP2的表达受硅酸钠诱 导。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114561399 A 2一种诱导马铃薯黑 痣病抗性基因StZFP2及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种具有提高马铃薯抗黑痣病、 清除活 性氧能力的基因及其应用。 背景技术 [0002]马铃薯(Solanum  tuberosum  L.)是世界第四大粮食作 物， 具有极高的营养价值和 抗衰老等功能被人们 所喜爱。 马铃薯因具有耐旱， 耐瘠薄和水分利用率高等特点被广泛种 植。 然而日益加剧的土传病害严重威胁着马铃薯产业的发展， 尤其是由丝核菌 (Rhizoctonia  sp.)侵染引起的马铃薯黑痣病， 对马铃薯的经济效益和食用价值均造成不 良影响， 成为中国马铃薯生产中的主要土传病害之一。 目前马铃薯黑痣病的防治措施主要 有生物防治、 化学防治及农业防治等方法， 品种间抗性差异较小， 抗病资源较少， 没有可以 利用的抗病品种。 [0003]硅作为地壳中的第二大元素， 不仅能够促进植物的生长还能增加植物的广谱抗 性。 研究表明硅可以参与植物和病原菌的相互作， 诱导抗病基因的表达。 但是， 硅诱导马铃 薯黑痣病抗性的研究未 见报道。 [0004]锌指蛋白(zinc ‑finger protein,ZFP)是一类重要的转录因子， 根据半胱氨酸和 组氨酸的数量和顺序的不同可以分为C2H2、 C3H、 C3HC4等亚型， 其中C2H2  型也被称为经典 型锌指蛋白， 一般包含特有且保守的QALGGH序列。 锌指蛋白基因的表达会增加甜椒植株对 于丁香假单孢杆菌(Pseudomonas  syringae)的抗性。 沉默掉锌指蛋白基因会降低辣椒植株 对青枯菌(Ralstonia  solanacearum)的抗性。 对马铃薯的研究发现， 锌指蛋 白基因表达会 增加植株对于致病疫霉  (Phytophthora  infestans)的抗性。 在马铃薯黑痣病的抗性研究 中未见有该基因的相关报道， 本课题在前期经过硅酸钠(NaSiO3·9H2O)诱导马铃薯组培苗， 高通量测序 获得转录组， 转录组数据筛选出上调明显差异的基因， 锌指蛋白基因  StZFP2， 将该基因转入马铃薯中， 过表达植株能提高对黑痣病菌的抗性。 因此， 欲通过硅酸钠诱导挖 掘马铃薯抗 黑痣病基因， 探究硅酸钠的诱 导抗性机理， 为 其应用提供理论依据。 发明内容 [0005]本发明公开了一种具有提高马铃薯黑痣病抗性、 清除活性氧能力的基因及其应 用。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]一种马铃薯诱导抗病基因StZFP2， 所述基因为锌指蛋白基因， 受硅酸钠诱导， 该基 因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示；说　明　书 1/8 页 3 CN 114561399 A 3