(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210225713.2 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510000 广东省广州市天河区五山路 483号华南农业大 学园艺学院913室 (72)发明人 曾灶海　郑家坤　夏瑞　徐婧　 刘元龙　 (74)专利代理 机构 广州市时代知识产权代理事 务所(普通 合伙) 44438 专利代理师 陈惠珠 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/10(2006.01) C40B 50/06(2006.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种单花蕾微 量RNA建库方法 (57)摘要 本发明公开了一种单花蕾微量RNA建库方 法， 该方法基于T n5转座酶进行 RNA/DNA杂合链片 段化并同时使cDNA两端带上接头， 从而能够省去 常规转录组建库技术中必需的RNA打断、 二链合 成等繁琐的操作步骤， 整个过程不需要进行mRNA 的富集， 直接总RNA投入建库， 大大降低了起始模 板投入量， 通过一步酶促反应也减少多个繁琐步 骤， 例如RNA片段化、 一链合成、 二链合成、 末端 修 复和接头连接等所带来的样品的损耗， 整个流程 总RNA需求 量大大降低， 且至少节省2个小时。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 114645074 A 2022.06.21 CN 114645074 A 1.一种单花蕾微 量RNA建库方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： pTXB1‑Tn5纯化步骤： 将pTXB1 ‑Tn5质粒转化感受态E.coli  Transett a DE3； 将单菌落 接种添加了抗生素的LB培养基中， 培养至OD600＝0.9； 加入0.25mM的异丙基 ‑β‑D‑硫代半乳 糖苷进行诱导表达至OD600＝3.0， 诱导表达后的菌液离心制成菌体； 加入HEGX裂解液和蛋 白酶抑制剂， 裂解释放蛋白质； 裂解产 物离心后取上清液加入PEI溶液， 离心除去沉淀物， 得 到的上清液进行层析； 接着裂解层析柱， 以实现pTXB1 ‑Tn5质粒从内含子上切割； 收集含目 的蛋白的液体， 得到Tn5蛋白未浓 缩液； 然后用超滤浓 缩柱透析， 得到Tn5转 座酶； RNA提取步骤： 取植物的单花蕾提取RNA； RNA反转录步骤： 取溶解了RNA的溶液， 加入oligo ‑dTVN引物和dNTP混合物， 制成RNA样 品溶液备用； 配置反转录反应体系， 所述反转录反应体系包括SuperScript  II逆转录酶、 RNase抑制剂、 Superscript  II第一链缓冲液、 二硫苏糖醇、 甜菜碱、 氯化镁、 模板转换寡核 苷酸； 将RNA样品溶 液加入反转录反应 体系中， 运行PCR反应， 获得RNA/DNA杂合产物； Tn5转座复合体组装和纯化步骤： 取功能嵌合端寡核苷酸与接头A、 取功能嵌合端寡核 苷酸与接头B分别逐步退火形成双链， 然后分别加入Tn5转座 酶孵育， 得到转座体A和转座体 B， 将转座体A和转 座体B混合后加入RNA/DNA杂合产物， 在缓冲缓中进行片段化； 单花蕾文库制备和测序步骤： 将片段化的RNA进行PCR扩增， 然后纯化， 获得出库产物， 用Qubit 2.0进行定量。 2.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于： 所述oligo ‑dTVN引物的 序列为5’ ‑AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT3 0VN‑3’。 3.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库 方法， 其特征在于： 所述反转录反应体系中， 模板转换寡核苷酸的序列为5 ’ ‑AAGCAGTGGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G ‑3’。 4.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于： RNA反转录步骤中， 反转 录PCR反应程序为： 42℃， 90mi n； 50℃， 2min； 42℃， 2mi n和70℃， 15mi n。 5.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于： 所述功能嵌合端寡核苷 酸的序列 为5‑CTGCTCTTATACACATCT ‑3， 所述接头A的序列 为5’ ‑TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTA TAAGAGACAG ‑3’， 所述接头B的序列为5 ’ ‑GTCTCGTG GGCTCGGAGATGTGTATA AGAGACAG ‑3。 6.如权利 要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于： Tn5转座复合体组装和纯 化步骤中， 所述缓冲剂包括10mM三羟甲基氨基甲烷、 5mM  MgCl2、 10％N,N ‑二甲基甲酰胺、 9％PEG80 00、 0.85mM ATP。 7.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于： 所述RNA提取步骤中， 采 用Trizol提取液从单花蕾中提取总RNA， 用氯仿进行离心分离， 再用异丙醇进行离心使RNA 沉淀于管壁和底部， 用乙醇洗涤后风干至透明状， 加入经过高温灭菌的双蒸水溶解RNA备 用。 8.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于， 将片段化的RNA进行PCR 扩增的步骤为： 往片段化RNA产物中添加100units的Superscript  II和1 x Q5High‑ Fidelity  Master Mix， 反应程序为42℃， 15min； 70 °， 15min； 接着加入5 μL  N5XX和5 μL N7XX 进行PCR扩增， 反应程序为72℃， 15min； 98℃， 30s； 10个循环98℃  20s， 60℃20s， 72℃   2min； ， 72℃， 5mi n。 9.如权利 要求8所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于： PCR扩增完成后， 用VAHTS  权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114645074 A 2DNA Clean Beads按1： 1的比例进行 纯化。 10.如权利要求1所述的单花蕾微量RNA建库方法， 其特征在于， 取用的单花蕾为荔枝或 者倒地铃的单花蕾。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114645074 A 3