(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210228682.6 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 上海海关动植物与食品检验检疫技 术中心 地址 200135 上海市浦东 新区上海市民生 路1208号 (72)发明人 俞禄珍　宋绍禕　李帅　于翠　 王一椒　李丽　 (74)专利代理 机构 南京申云知识产权代理事务 所(普通合伙) 32274 专利代理师 邢少华　邱兴天 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鳞球茎茎线虫的LAMP快速 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种鳞球茎茎线虫的LAMP快 速检测方法， 属于植物病害的分子生物学检测领 域。 包括以下步骤： 1)以待测样品的DNA为模板， 利用鳞球茎茎线虫的LA MP引物组进行LA MP扩增； 2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中 是否含有鳞球茎茎线虫； 其中， LAMP引物组包括 一对外引物F3/B3， 一对内引物FIP/BIP和一对环 引物LF/LB， 引物的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO.1‑SEQ ID NO.6所示。 本发明快速、 便捷； 特异 性强； 灵敏度较高； 步骤简单； 结果判定简便； 同 时对人和环境安全， 检测过程不需要使用EB等有 毒试剂， 能够满足检验检疫一线实验室快速、 准 确鉴定鳞球茎茎线虫的检测需求。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图4页 CN 114525348 A 2022.05.24 CN 114525348 A 1.一种鳞球茎 茎线虫的LAMP快速检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)以待测样品的DNA为模板， 利用鳞球茎 茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增； 2)根据是否发生特异性的扩增判断待测样品中是否含有鳞球茎 茎线虫； 所述鳞球茎茎线虫的LAMP引物组包括一对外引物F3/B3， 一对内引物FIP/BIP和一对环 引物LF/LB， 引物的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示。 2.根据权利要求1所述的鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法， 其特征在于， 若发生特异 性的扩增， 则表明待测样品中含有鳞球茎茎线虫； 若 未发生特异 性的扩增， 则表明待测样品 中不含有鳞球茎 茎线虫。 3.一种鳞球茎 茎线虫的LAMP快速检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)以待测样品的DNA为模板， 利用鳞球茎茎线虫的LAMP引物组进行LAMP扩增， LAMP扩增 的反应体系中还 包括有荧 光染料； 2)根据扩增产物的显色情况判断待测 样品中是否含有鳞球茎茎线虫， 实现鳞球茎茎线 虫的LAMP可视化检测； 所述鳞球茎茎线虫的LAMP引物组包括一对外引物F3/B3， 一对内引物FIP/BIP和一对环 引物LF/LB， 引物的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示。 4.根据权利要求3所述的鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法， 其特征在于， 所述荧光染 料为钙黄绿素； 当扩增产 物呈绿色， 则表明待测样品中含有鳞球茎茎线 虫； 当扩增产 物呈橙 黄色， 则表明待测样品中不含有鳞球茎 茎线虫。 5.根据权利 要求3所述的鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法， 其特征在于， LAMP扩增的 反应体系为： 2.5 μL待测样品的DNA模板、 LAMP引物组中每条引物各1μL、 反应酶1μL、 荧光染 料1 μL、 RM反应液12.5 μL， 用去离 子水补足体系， 总反应 体系体积为25 μL。 6.根据权利 要求3所述的鳞球茎茎线虫的LAMP快速检测方法， 其特征在于， LAMP扩增的 反应条件为： 6 3℃恒温反应45mi n； 80℃灭活5mi n结束反应。 7.用于快速检测鳞球茎茎线虫的LAMP引物组， 其特征在于， 所述引物组包括SEQ  ID  NO.1所示的正向外引物F3， SEQ  ID NO.2所示的反 向外引物B3， SEQ  ID NO.3所示的正向内 引物FIP， SEQ  ID NO.4所示 的反向内引物BIP， SEQ  ID NO.5所示的正向内引物LF， SEQ  ID  NO.6所示的反向内引物LB。 8.权利要求7所述的LAMP引物 组在快速检测植物 组织样品中是否含有鳞球茎茎线虫中 的应用。 9.权利要求7所述的LAMP引物 组在快速检测混合线虫样品中是否含有鳞球茎茎线虫中 的应用。 10.一种快速检测鳞球茎茎线虫的试剂盒， 其特征在于， 试剂盒中包括权利要求7所述 的LAMP引物组。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114525348 A 2一种鳞球茎 茎线虫的LAMP快速检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于植物病害的分子生物学检测领域， 具体涉及一种鳞球茎茎线虫的LAMP 快速检测方法。 背景技术 [0002]鳞球茎茎线虫(Ditylenchus  dipsaci)隶属 于线虫动物门、 垫刃目、 粒科、 茎线虫 属， 能引起多种植物毁灭性病害， 是世界公认的危险性线虫， 被列入我国检疫性有害生物名 录。 鳞球茎茎线虫的寄主范围极广， 可寄生约40科500种植物， 包括甘薯、 马铃薯、 燕麦、 甜 菜、 洋葱、 水仙、 风信子、 郁金香、 唐菖蒲、 朱顶红等。 [0003]研究表明， 当每500g土壤中有10条线虫时就可严重危害洋葱、 甜菜、 胡萝卜等植 物， 严重侵染时损失可达60％～80％。 在意大利， 该线虫为害洋葱， 种植之前苗期死亡率达 60％； 而法国和荷兰大蒜受侵染损失超过90％。 [0004]目前， 鳞球茎茎线虫的鉴定以传统的形态学鉴定为主， 必要时辅以分子生物学方 法开展。 但常规的特异引物PCR方法对设备要求高： 需PCR仪、 凝胶电泳仪等设备。 环介导等 温扩增(loop ‑mediated  isothermal amplification， LA MP)技术是近年来发展的一种新颖 和较成熟的等 温核酸扩增技术。 与PCR方法相比， LAMP不需要P CR仪， 扩增产 物通过肉眼观察 或浊度仪即可判定结果， 适 合于现场或条件较差的实验室进行 快速检测。 [0005]因此， 建立一种鳞球茎茎线虫的LAMP检测方法， 以期能够快速、 准确、 灵敏、 无污 染 的检测该线虫， 是十分 迫切和必要的。 发明内容 [0006]针对现有技术存在的上述问题， 本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种鳞 球茎茎线 虫的LAMP快速检测方法； 本发 明所要解决 的第二技术问题在于提供一种用于快速 检测鳞球茎茎线 虫的LAMP引物组； 本发 明所要解决 的第三技术问题在于提供该LAMP引物组 的应用。 [0007]为了解决上述 技术问题， 本发明所采用的技 术方案如下： [0008]本申请根据NCBI公布的鳞球茎茎线虫及其近似种序列进行了大量的研究、 分析： 包括线虫属内比较、 属间比较， 以及其它大量其它物种进行比较。 设计了一种快速检测鳞球 茎茎线虫的LAMP引物组， 包括SEQ  ID NO.1所示的正向外引物F3， SEQ  ID NO.2所示的反 向 外引物B3， SEQ  ID NO.3所示的正向内引物FIP， SEQ  ID NO.4所示的反向内引物BIP， SEQ  ID  NO.5所示的正向内引物LF， SEQ  ID NO.6所示的反向内引 物LB。 外引 物F3/B3、 内引物FIP/ BIP能够针对鳞球茎茎线虫的基因上的6个区域进行识别扩增， 分别位于3 ′端的F3c区段， F2c区段， F1c区段和5 ′端的B1区段， B2区段， B3区段。 通过增加一对环引物LF/LB， 促进LAMP 反应， 提升反应速率， 缩短反应时间。 [0009]引物的核苷酸序列具体如下： [0010]F3： CGGGATTGCTTTTTGGTGAGA；说　明　书 1/8 页 3 CN 114525348 A 3