(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210228249.2 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 珠海市现代农业发展中心 （珠海市 金湾区台湾农民创业园管理委员 会、 珠海市农渔业科研与推广中心） 地址 519000 广东省珠海市香洲区永南路 33号隆盛大厦1栋二楼、 四楼 申请人 中山大学 (72)发明人 李勇　李水生　郭建谊　张晋　 盘润洪　张勇　古群红　李桂峰　 罗志平　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽(51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种黄鳍鲷微 卫星家系鉴定的方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种黄鳍鲷微卫星家系鉴定 的方法， 包括以下步骤： (1)黄鳍鲷全同胞家系建 立； (2)黄鳍鲷亲本和子代 基因组DNA提取； (3)多 态性微卫星引物筛选； (4)荧光标记8重PCR体系 开发和扩增； (5)微卫星位点基因分型及家系鉴 定： (5.1)确定亲本和家系个体在各微卫星位点 上对应的基因型； (5.2)家系鉴定。 该方法首次在 黄鳍鲷上利用荧光修饰的多态微卫星标记建立 了亲子鉴定平台， 鉴定准确率高， 快速， 成本低。 还公开了 上述方法在黄鳍鲷的群体遗传学评价、 系谱认证、 亲子鉴定、 分子标记辅助家系管理和 分子标记辅助亲本 选择方面的应用。 权利要求书2页 说明书6页 CN 114592070 A 2022.06.07 CN 114592070 A 1.一种黄鳍鲷微 卫星家系鉴定的方法， 其特 征是包括以下步骤： (1)黄鳍鲷全同胞家系建立 利用养殖的黄鳍鲷作为亲本， 进行人工繁殖， 建立全同胞家系分养， 从每个家系中选取 仔鱼， 作为家系鉴定的样本； (2)黄鳍鲷亲本和子代基因 组DNA提取 选取步骤(1)中黄鳍鲷亲本和仔鱼的鳍条组织， 提取亲本和子代的基因组DNA， 保存待 用； (3)多态性 微卫星引物筛 选 从黄鳍鲷转录 组测序中筛选获得8个微卫星位点Y1、 Y2、 Y3、 Y4、 Y6、 Y8、 Y9、 Y10， 根据8个 微卫星位点， 设计8对微卫星引物， 分别为引物对Y1、 引物对Y2、 引物对Y3、 引物对Y4、 引物对 Y6、 引物对Y8、 引物对Y9和引物对Y10； (4)荧光标记8重PCR体系开发和扩增 将步骤(3)中筛选出来的8对引物， 设计成一个8重PCR体系， 在8对引物的正向引物的5 ’ 端分别用FAM、 HEX、 TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰， 采用荧光PCR反应对步骤(2)中亲 本及子代的DNA样品进行PCR扩增； (5)微卫星位点基因分型及家系鉴定 (5.1)确定亲本和家系个 体在各微 卫星位点上对应的基因型 将步骤(4)中8重PCR扩增产物在测序仪上进行分型； (5.2)家系鉴定 对亲本基因型和子代基因型进行分析， 判定 子代个体的父母本 。 2.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(2)中采用醋 酸铵法提取 亲本和子代的基因 组DNA。 3.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(3)中所述引 物Y1、 引物对Y2、 引物对Y3、 引物对Y4、 引物对Y6、 引物对Y8、 引物对Y9、 引物对Y10的碱基序 列分别如SEQ  ID NO： 1～16所示。 4.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(4)中8重PCR 体系包括： 浓度为10 μmol/L的引物对Y1  0.5 μL、 浓度为10 μmol/L的引物对Y2  0.3 μL、 浓度为 10 μmol/L的引物对Y3  0.4 μL、 浓度为10 μmol/L的引物对Y4  0.5 μL、 浓度为5 μmol/L的引物对 Y6 0.5 μL、 浓度为5 μmol/L的引物对Y8  0.6 μL、 浓度为5 μmol/L的引物对Y9  0.6 μL、 浓度为5 μ mol/L的引物对Y10  0.4μL、 浓度为100ng/μL的DNA  3μL、 ddH2O 6.2μL、 Taq PCR  StarMix 12 μL、 总计25 μL。 5.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(4)中在引物 对Y1、 引物对Y2、 引物对Y3的正向引物的5 ’端标记荧光物质FAM， 在引物对Y4、 引物对Y6的正 向引物的5 ’端标记荧光物质HEX， 在引物对Y8、 引物对Y9、 引物对Y10的正向引物的5 ’端标记 荧光物质TAMRA。 6.根据权利 要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(4)中PCR扩增 时， PCR反应程序为： 94℃ 预变性5min， 然后94℃30s， 退火温度59℃30s， 72℃30s， 共30个循 环， 最后72℃延伸10mi n。 7.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(5.1)中将步权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114592070 A 2骤(4)中8重PCR扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型， 用GS ‑500作为内参， 用 GeneMarker  V1.5软件读取每 个样品的基因型。 8.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(5.2)中采用 CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析， 判定子代个体的父母本， 该结果与 已知的实际家系信息进行比较， 最终判断家系鉴定的成功。 9.根据权利要求8所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法， 其特征是： 步骤(5.2)中采用 软件CERVUS  3.0对亲本基因型和子代基因型进行分析时， 采用软件CERVUS  3.0计算亲本基 因型和子代基因型在各微卫星座位上等位基因频率、 杂合度、 期望杂合度、 多态信息含量、 平均排除概率、 Hardy ‑Weinberg平衡及无效等位基因频率， 并跟据LOD值鉴定每个家系个体 的父母本 。 10.权利要求1所述方法在黄鳍鲷的群体遗传学评价、 系谱认证、 亲子鉴定、 分子标记辅 助家系管理和分子标记辅助亲本 选择方面的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114592070 A 3