(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210221988.9 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 江汉大学 地址 430056 湖北省武汉市沌口经济技 术 开发区新江大路8号 (72)发明人 彭海　张静　谭生龙　肖华锋　 李甜甜　李论　方治伟　高利芬　 周俊飞　陈利红　万人静　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 专利代理师 刘杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测转基因番木瓜的引物对组合、 试剂盒及 检测方法 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 特别涉及一种检 测转基因番木瓜的引物对组合、 试剂盒及检测方 法。 所述引物对组合其核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1至SEQ  ID NO.16所示； 通过一次高通量检 测， 实现多种转基因成分的定性与定量检测， 避 免了现有Real ‑time技术需要进行多次扩增和检 测才能覆盖样本中的多个靶 标转基因成分， 同时 避免了该技术出现的假阳性 或假阴性结果， 因此 本申请的引物对组合具有高效、 准确和灵敏的优 势， 应用前 景较好。 权利要求书1页 说明书13页 序列表4页 附图1页 CN 114622028 A 2022.06.14 CN 114622028 A 1.一种检测转基因番木瓜的引物对组合， 其特 征在于， 所述引物对组合包括 特异性扩增p3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示； 特异性扩增t3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3至SEQ ID NO.4所示； 特异性扩增pNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5至SEQ ID NO.6所示； 特异性扩增tNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； 特异性扩增NPtI I的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9至SEQ  ID NO.10所示； 特异性扩增PRSV_CP的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ ID NO.12所示； 特异性扩增repl icase的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13至SEQ ID NO.14所示； 和/或， 特异性扩增GUS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.15至SEQ ID NO.16所示。 2.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特 征在于， 所述引物对组合包括： 特异性扩增Rainbow ‑left的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.17至SEQ  ID NO.18所 示； 特异性扩增Rainbow ‑right的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.19至SEQ  ID NO.20 所示； 和/或， 特异性扩增华农1号的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.21至SEQ  ID NO.22 所示。 3.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括用于扩增番 木瓜内参基因CaP_papai n的引物对。 4.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 扩增番木瓜内参基因CaP_papain的 引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.23至SEQ ID NO.24所示。 5.根据权利要求1所述的引物对组合， 其特征在于， 所述引物对组合还包括： 特异性扩 增选自下组的番木瓜转基因元件的引物对： p35S、 t35S、 pNOS、 tNOS、 NPtII、 PRSV_CP、 replicase和GUS； 所述引物对组合还包括特异 性扩增选自下 组的番木瓜转基因品系特异性 序列的引物对： Rai nbow‑left、 Rai nbow‑right和华农1号。 6.一种检测转基因番木瓜的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1 ‑5任意一 项所述的检测转基因番木瓜的所述引物对组合。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括第一容器， 所述第一容 器内含有所述引物对组合。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括多重PCR预混液。 9.权利要求1 ‑5任意一项所述的引物对组合、 权利要求6 ‑8任意一项的述的检测试剂盒 在检测番木瓜及其相关产品中的应用。 10.一种检测转基因番木瓜的方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 得到待测番木瓜的DNA和权利要求1 ‑5任意一项所述的引物对组合； 以所述DNA为模板， 将所述引物对组合加入反应 体系中， 进行扩增反应， 得到扩增产物； 将所述扩增产物进行高通 量测序， 得到高通 量文库； 将所述高通 量文库中的基因序列进行分析， 得到检测转基因番木瓜的结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114622028 A 2检测转基因番木瓜的引物对组合、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 特别涉及一种检测转基因番木瓜的引 物对组合、 试剂 盒及检测方法。 背景技术 [0002]番木瓜是全球普遍种植的作物， 含有丰富的植物蛋白和食用油脂， 是重要的食用 和饲用作物。 在当前难以大幅增加番木瓜种植面积的背景下， 利用现代生物技术培育高产 优质转基因番木瓜新品种， 对于促进番木瓜产业振兴具有十分重要的意义。 但随着大量的 转基因番木瓜被直接或间接地制成食品以及国际社会对转基因产品安全性问题的日益关 注， 农产品中的转基因成分检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目并逐渐得到加强。 因此， 开发高效、 便捷的转基因食品检测技 术显得至关重要。 [0003]转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。 目 前基于核酸的P CR检测方法仍是目前最普遍、 最准确的转基因检测技术， 其主要包括普通定 性PCR、 巢式PCR、 环介导等温扩增技术(LAMP)、 荧光定量PCR多重PCR等方法。 相对于普通定 性PCR方法， 巢式PCR高了检测的灵敏度， 容易造成假阳性。 LAMP操作简单、 特异性 强， 然而引 物设计较为复杂， 容易造成DNA污染， 影响后续的实验。 荧光定量PCR方法具有重复性好、 灵 敏度高、 核酸交叉污染少的优点， 但其 成本高， 并且需要 特殊检测仪器。 普通的多重P CR方法 可以在一个反应中同时检测多个基因， 但一般不超过六重， 否则引物之间干扰较大， 影响检 测效果。 基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术， 它们均具有高通量、 灵 敏度高、 特异性 强等优点， 且可平行检测1个转基因作物中多个基因或同时检测多种转基因 作物； 然而其成本高昂， 需要专门的仪器设备， 要求操作人员具有较高的专业素质， 这些因 素限制了该技 术在检测中的广泛应用。 [0004]因此研发一种高效、 灵敏和通量高的转基因产品检测方法， 成为亟待解决的关键 问题。 发明内容 [0005]本申请提供了一种检测番木瓜转的引 物对组合、 试剂盒及检测方法， 以解决如何 高效检测转基因番木瓜和品系的技 术问题。 [0006]第一方面， 本申请提供了一种检测转基因番木瓜 的引物对组合， 所述引 物对组合 包括: [0007]特异性扩增p3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.2所示； [0008]特异性扩增t3 5S的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3至SEQ ID NO.4所示； [0009]特异性扩增pNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5至SEQ ID NO.6所示； [0010]特异性扩增tNOS的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.8所示； [0011]特异性扩增NPtI I的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9至SEQ  ID NO.10所示； [0012]特异性扩增PRSV_CP的引物对， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11至SEQ  ID NO.12所说　明　书 1/13 页 3 CN 114622028 A 3