(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210214355.5 (22)申请日 2022.03.07 (71)申请人 江西省农业科 学院水稻研究所 地址 330000 江西省南昌市青云谱区南 莲 路602号 (72)发明人 胡标林　吴婷　李霞　严松　 (74)专利代理 机构 北京和信华成知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11390 专利代理师 申龙华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种水稻异源胞质育性恢复QTL qRf5.1的 分子标记及其应用 (57)摘要 本发明属于水稻育种及分子生物学技术领 域， 具体涉及一个调控水稻异源 胞质不育育性恢 复的主效QTLs位点的SSR分子标记及其应用(见 图1)。 该标记正反向引物序列分别为5 ' ‑ G A G T G G A A A T G G C A C T T A ‑3 '和 5 ' ‑ ATTTCACCTCCCTCATCT ‑3'， 利用上述引物对水稻 样品基因组DNA进行PCR扩增， 并对扩增产物进行 电泳检测， 发现扩增条带大小为202bp的水稻品 种具有恢复育性的功能。 本发明对于筛选和选育 水稻异源胞质不育系恢复系具有重要应用价 值。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 114672581 A 2022.06.28 CN 114672581 A 1.一种水稻异源胞质育性恢复QTL  qRf5.1的分子标记， 其特征在于， 包括调控水稻异 源胞质育性恢复的主效QTL， 所述主效QTL位于水稻第05号染色体上， 命名为qRf5.1； 区间遗 传距离为104.8c M～110.6cM， 物理距离为21,378,343～ 22,671,210bp； 还包括用于检测与异源胞质不育育性恢复的主效QTLs的SSR引物对RF01， 所述引物对 RF01具有下述1)～3)任一项 核苷酸序列之一： 1)所述引物对RF01中上游引物的核苷酸序列为序列表中SEQ  ID NO.1所示的核苷酸序 列， 所述引物对RF01中下游引物的核苷酸序列为序列表中SEQ  ID NO.2所示的核苷酸序列； 2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ  ID NO.1或SEQ  ID NO.2限定的DNA序列杂交的核 苷酸序列； 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性， 且能扩增出水稻育性恢复相关基因 的序列； RF01‑F： 5'‑GAGTGGAAATGGCACTTA‑3'(SEQ ID NO.1) RF01‑R： 5'‑ATTTCACCTCCCTCATCT‑3'(SEQ ID NO.2)。 2.根据权利要求1所述的水稻异源胞质育性恢复QTL  qRf5.1的分子标记， 其特征在于， 用于检测SSR分子标记的引物对RF01在制备用于检测或辅助选择水稻育性恢复基因qRf5.1 的试剂盒 或PCR试剂中的应用； 所述试剂盒 或PCR试剂包括权利要求1所述的引物对RF01。 3.根据权利要求2所述的水稻异源胞质育性恢复QTL  qRf5.1的分子标记， 其特征在于， 所述试剂盒 或PCR试剂还 包含有PCR技 术常用的试剂。 4.根据权利要求3所述的水稻异源胞质育性恢复QTL  qRf5.1的分子标记， 其特征在于， 所述的试剂盒或PCR试剂在检测水稻异源胞质育性恢复基因qRf5.1和 /或在水稻恢复系分 子标记辅助选择育种中的应用。 5.一种检测水稻育性恢复分子标记辅助育种方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步 骤： (1)提取待测水稻样品基因 组DNA； (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 采用权利要求1所述引物对RF01进行PCR扩增， 获得PCR扩增产物； (3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行浓度 为6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 如 果该待测水稻样品扩增出大小为202bp的条带， 则该待测水稻携带异源恢复育性基因 qRf5.1的水稻品系或候选的育性恢复基因水稻品系。 6.根据权利要求5所述的检测水稻育性恢 复分子标记辅助育种方法， 其特征在于， 步骤 (2)所述PCR扩增的反应体系为： 2 ×Tolo FastTaq Premix 5.0 μl， 10pmol/ μl的权利要求1 引物对RF01  1 μl， 300‑500ng/ μl的水稻基因 组模板DNA  1 μl， 加灭菌后的超纯 水至10 μl。 7.根据权利要求5所述的检测水稻育性恢 复分子标记辅助育种方法， 其特征在于， 步骤 (2)所述PCR扩增的反应程序为： 95℃预变性5min； 95℃变性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸 45s， 循环3 5次； 最后72℃延伸10mi n； 扩增产物在4℃下保存。 8.根据权利要求5 ‑7任意一项所述的检测水稻育性恢复分子标记辅助育种方法， 其特 征在于， 所述的水稻携带育性恢复基因qRf5.1。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672581 A 2一种水稻异源胞质育性恢复Q TL qRf5.1的分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及水道育种技术领域， 具体是指 一种水稻异源胞质育性恢复QTL  qRf5.1 的分子标记及其应用。 背景技术 [0002]水稻是全球最重要的三大粮食作物之一， 世界上超过50％人群以稻米为主食， 因 此水稻的高产、 稳产与全球粮食安全和社会稳定密切相关。 杂种优势利用能有效地提高农 作物产量、 品质和抗性。 水稻三系成功配套， 极大推动了水稻杂种优势的利用和杂交水稻的 在中国大规模推广应用， 其种植 面积占到水稻种植 面积的1/2(袁隆平等， 2010)。 [0003]水稻细胞质雄性不育和恢复基 因的发掘和利用极大提升我国杂交水稻的研究。 三 系杂交稻的商业化应用除了需培育出优良的不育系外， 还要选育与之配套的优良恢复系。 因此， 在三系杂交水稻研究 的过程中， 恢复基因的研究备 受关注。 随着分子生物学技术迅猛 快速的发展， 极大推动了水稻细胞质雄性不育及其育性恢复的分子机理研究。 自20世纪70 年代起， 国内外研究者对野败型(CMS ‑WA)、 红莲型(CMS ‑HL)、 包台型(CMS ‑BT)和矮败型 (CMS‑DA)等不同类型CMS开展了育性恢复QTL分析， 在水稻12条染色体上检测到超 过75个不 同胞质类型育性恢复QTL， 其中野败 型恢复基因Rf4、 红莲型育性恢复基因Rf5和Rf6、 包台型 恢复基因Rf1(Rf1a和Rf1b)、 Ifr1、 Lead ‑Rice型恢复基因Rf2以及CW型恢 复基因Rf17等7个 恢复基因被克隆(段琉颖等， 2022)。 如， 庄杰云等(2001)在1号染色体RG532 ‑RG472区间上定 位到野败型恢复基因qRf1， 其表型贡献率为43.0％； Ngangkham等(2010)利用Pusa6A和 PRR78构建的F2群体将野败型育性恢复QTL  Rf4精细定位至区间RM6737 ‑RM6100， 其物理位 置约104kb。 这些报道到的不同胞质不育类型的育性恢复QTLs/基因中绝大部分来自栽培稻 和地方品种， 有关野生稻恢复基因的发掘和定位研究较为薄弱。 [0004]自我国三系杂交稻 成功配套后， 涌现了IR24、 IR26、 IR30、 明恢63、 扬稻6号(9311) 以及华占等一批王牌的骨干籼型恢复系， 然而这些骨干恢复系遗传背景单一， 其系谱大部 分含有东南亚地区农家品种Peta的遗传成分， 属于南亚、 东南亚中籼生态型， 这大大限制高 产优质杂交组合的培育。 因此， 三系杂交稻育种中亟需丰富恢复系的遗传 多样性。 东乡野生 稻是迄今世界分布最北的普通野生稻(Oryza  rufipogon  Griff)， 是江西特有的野生资源， 研究表明东乡野生稻对多种细胞质雄性不育具有恢复特性(张金伟等， 2011)。 从东乡野生 稻中发掘并利用细胞质雄性不育恢复源对促进杂交水稻的发展具有深远的意义。 本发明在 水稻第5号染色体上定位并验证了东乡野生稻的异源胞质育性恢复基因qRf5.1， 并且获得 其紧密连锁的分子标记， 对促进其在恢复系选 育及分子标记辅助育种具有重要的意 义。 [0005]传统的水稻育种主要是通过表型选择， 这不仅要求研究人员具有丰富的经验， 而 且育种年限长达数年甚至十几年的时间。 因此， 结合分子生物学与基因组学 的研究手段与 方法， 快速检测和 辅助选择水稻育性恢复的目标基因/QTL， 进行恢复系分子育种改良加快 育种进程， 实现新的突破。 本领域的技术人员致力于开发一种 可以快速检测水稻材料水稻 育性恢复基因qRf5.1的分子标记， 进 而实现育性恢复基因qRf5.1的分子 育种应用。说　明　书 1/5 页 3 CN 114672581 A 3