(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210227948.5 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 武汉兰丁云医学检验实验室有限公 司 地址 430073 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新大道818号高科医疗器械园7 号生产孵化楼B7东北向一、 二层， 南向 一层 (72)发明人 郝宗杰　曹得华　李仲娟　龙莉　 严姗　李荣　刘赛　庞宝川　 孙小蓉　 (74)专利代理 机构 武汉维盾知识产权代理事务 所(普通合伙) 42244 专利代理师 彭永念(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6862(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速新冠病毒N501Y突变变体的检测方 法 (57)摘要 本发明涉及一种快速新冠病毒N501Y突变变 体的检测方法， 通过引物设计， 引物SL1和SL2可 以完全与正常型H1N1的DNA， 而引物SL1和SL2与 突变型DNA存在一个碱基差异。 当高温连接酶的 催化下， 只有SL1和SL2连接成一条完整的茎环 状 结构时， 才是后续LAMP基因扩增循环的起始结 构。 连接反应的产物 （茎环状结构产物） ， 用LAMP 方法进行核 酸扩增， 根据LAMP反应产生颜色变化 进行结果判读。 本发明基于RNA连接酶技术， 无需 反转录技术， 且反应时间短， 连接时间 （15分钟） 和LAMP反应 （15分钟） 合计30分钟； 能够 精准识别 一个碱基的差异； 设备要求简单， 无需荧光定量 PCR仪， 反应只 需金属浴； LAMP结果可视化， 终点 判定简单。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图2页 CN 114561493 A 2022.05.31 CN 114561493 A 1.一种新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系， 其特征在于， 所述反应体系包括引 物、 置换引物和扩增引物， 引物SL1： AGTGGGTTGGAAACCATATCGACAGCAGAGGATCCGCTCACACTTCCACACAACAAATCCTCTG CTGTCG； 引物SL2： ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGTTGGTAACCAAC ACCATA； 置换引物FIP： CGACAGCAGAG GATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCG G； 置换引物BIP： ATCGTCGTGACTGT TTGTAATAGGACAGAGC CCCGCAC； 扩增引物FL： C CAGTCACGACGATGT TG； 扩增引物BL： CAGCAGAG GATTTGTTGTG。 2.根据权利要求1所述新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系， 其特征在于， 所述 N501Y突变体包括野生型和突变型序列， 野生型和突变型序列分别为SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO: 8。 3.采用权利要求1 ‑2任意一项所述检测反应体系进行快速新冠病毒N501Y突变变体的 检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 第一步： 基于连接酶链的反应： 在突变型序列病毒株和连接酶作用下， SL1和 SL2引物连 接形成一个哑铃结构模板； 第二步： 以上述哑铃结构模板， 启动LAMP快速扩增。 4.根据权利要求3所述检测反应体系进行快速新冠病 毒N501Y突变变体的检测方法， 其 特征在于， 所述方法包括以下步骤： 第一步是依赖连接酶的链接反应： 1.1 链接酶： HiFi Taq DNA L igase (NEB, M 0647)； 1.2 DNA模板： 根据公布新冠病毒N501Y的序列， 将野生型新冠病毒N501Y ‑W和突变型新 冠病毒N5 01Y‑M的序列构入到质粒中， 作为后续实验 模板， 质粒浓度为1* 103copies/ul； 1.3 SL1引物和SL2引物生工合成， 用去离 子水稀释成10 µM的工作液； 1.4 链接反应 体系的温度和引物浓度： 浓度为20nM， 10 X HiFi T aq DNA Ligase Buffer: N501Y野生型取5 µl， N501Y突变型取5 µl， NTC 取5 µl； HiFi Taq DNA L igase： 野生型 取1 µl ， N501Y突变型 取1 µl， NTC取0 µl， DNA： 野生型 取1ul ， N5 01Y突变型 取1ul， NTC取1ul， SL1： 野生型 取0.1µl， N501Y突变型 取0.1µl， NTC取0.1 µl， SL2： 野生型 取0.1µl ， N501Y突变型 取0.1µl， NTC取0.1 µl， H2O： 野生型 取42.8µl， N501Y突变型 取 42.8µl， NTC取43.8 µl， Total： 野生型 取50µl， N501Y突变型 取50µl， NTC取5 0µl， 链接反应温度58℃； 反应时间15mi n， 得到连接反应产物； 第二步环介导 等温扩增： 2.1 WarmStar t LAMP Kit(NEB, E170 0)， 天根恒温金属浴； 2.2取上述1.0 µL的连接反应产物作为LAMP反应的核酸模板， 其中NTC用去离子水代 替， 具体反应 体系为：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114561493 A 2WarmStart  Colorimetric  LAMP 2X Master Mix： 正常型DNA  12.5µl， 突变型DNA  12.5 µl， 去离子水12.5 µl FIP和BIP： 正常型DNA  1µl， 突变型DNA  1µl， 去离子水1µl， FL和BL： 正常型DNA  1µl， 突变型DNA  1µl， 去离子水1µl， Target DNA： 正常型DNA  1µl， 突变型DNA  1µl， 去离子水0µl， dH2O： 正常型DNA  9.5µl， 突变型DNA  9.5µl， 去离子水10.5 µl， Total Volume： 正常型DNA  25µl， 突变型DNA  25µl， 去离子水25µl； FIP和BIP反应终浓度为16 0nM,FL和·BL反应终浓度为 40nM； 2.3 LAMP反应条件， 上述25 µl放置在金属浴中， 65℃恒温加 热， 反应15分钟后结束； 观 察反应液体颜色变化； N501Y突变型反应颜色从粉红色变成黄色； N501Y野生型或者NTC依旧 是粉红色。 5.一种应用权利要求1 ‑4任一项所述新冠病毒N501Y突变变体的检测反应体系的检测 产品。 6.一种应用权利要求 4所述检测方法的检测产品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114561493 A 3