(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210227842.5 (22)申请日 2022.03.08 (71)申请人 南京易基 诺环保科技有限公司 地址 210000 江苏省南京市江宁开发区将 军大道37号翠屏科创园五层楼3521房 间(江宁开发区) (72)发明人 孙晶莹　杨江华　张效伟　 (74)专利代理 机构 深圳博敖专利代理事务所 (普通合伙) 44884 专利代理师 张秀丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于环 境DNA的鼋 现场核酸检测试剂盒 及其使用方法 (57)摘要 一种基于环 境DNA的鼋 现场核酸检测试剂盒 及其使用方法， 鼋现场核酸检测试剂盒包括引物 组、 探针、 核酸检测试纸条、 重组酶、 聚合酶、 ddH2O、 PCR缓冲液及核酸抽提试剂盒， 本发明是 基于我国鼋全线粒体组设计， 在模板浓度 50Copies/μl时可以实现80％的稳定扩增， 超过 50Copies/μl时可以实现100％稳定扩增， 具有 特异性好、 稳定性高的特点， 等温PCR扩增中成功 率高， 可以很好对鼋DNA进行PCR扩增， 减少其他 生物DNA如鱼类DNA对结果带来的假阳性干 扰。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 115074448 A 2022.09.20 CN 115074448 A 1.一种基于环境DNA的鼋现场核酸检测试剂 盒， 其特征在于， 包括引物 组、 探针、 核酸检 测试纸条、 重 组酶、 聚合酶、 ddH2O、 PCR缓冲液及核酸抽提试剂盒， 所述核酸抽提试剂盒包括 无菌注射器、 集成0.45微米孔径滤的针筒式过滤器、 裂解液、 中和管、 洗涤管、 洗脱管、 磁珠、 磁棒； 所述引物组上游引物序列为： TACGCTGCAGGCCCATTCGC(5 ’ ‑3’)， 引物组下游引物序列 为： TCCGGGTGAATTGTTGGTGGGA(5 ’ ‑3’)， 下游引物的5 ’端标记生物素Biotin； 探针的序列为： TCCCACCAACAATTCACCCGGA(5 ’ ‑3’)， 5’端标记FA M； 探针3’端标记标记BHQ1； 核 酸检测试纸条 上有C线和T 线， 其中， C线上埋有生物素抗体， T 线埋有FAM基团抗体。 2.一种基于环境DNA的鼋现场核酸检测试剂盒的使用方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： S1： 现场用无菌注射器吸取水样， 将注射器旋到针筒过滤器上， 用力推注射器让水样全 部通过针筒过 滤器， 重复该操作直到针筒过 滤器堵塞为止， 取 下无菌注射器； S2： 向针筒过滤器中加入2mL裂解液， 用手震荡针筒过滤器2min， 将针筒过滤器中的液 体吸出到装有中和液的1.5mL离心管中， 加入磁珠并上 下颠倒混匀3 ‑5次； S3： 将带磁棒套的磁棒插入离心管中静置1min， 待磁珠被全部吸附到磁棒后， 将磁棒插 入1mL洗涤管中， 取出磁棒， 上下颠倒混匀3 ‑5次； 将磁棒插入洗脱管中， 取下磁棒套， 上下颠 倒混匀5‑10次后静置2mi n， 待DNA充分解离后取 出带磁棒套的磁棒； S4： 向PCR扩增管中依次加入0.1μL重组酶， 0.1 μL聚合酶， 2 μL的上游引物， 2 μL的下游引 物， 1 μL探针， 2 μL的环境DNA， 25 μL的PCR缓冲液和17.8 μL的d dH2O； S5： 用手紧紧握住反应管持续15 ‑20min， 反应结束后， 取10μL用无菌水稀释20倍， 混合 均匀； 取50 μL混合均匀的反应液加入到核酸检测试纸条的加样孔中， 3 ‑5min后读取试纸条 上的结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074448 A 2一种基于环境 DNA的鼋现场核酸检测试剂盒及其使用方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体为一种基于环境DNA的鼋现场核酸检测试剂盒及 其使用方法。 背景技术 [0002]全中国的巨型淡水鳖类， 都被称为"鼋"， 列为中国国家一级重点保护动 物， 鼋主要 栖息于内陆、 流动 缓慢的淡水河流和溪流中， 是一种 珍稀的淡水爬行动物。 然而， 由于人们 长期大肆捕杀， 生存环境不断恶化， 加上其栖息环境受到污染和破坏， 导致鼋的数量 急剧减 少， 濒临灭绝， 亟待加强监测与保护。 由于鼋不常迁移， 喜欢栖息在水底， 白天隐于水中， 偶 尔出水面呼吸， 夜间在浅滩 处觅食， 极难被人发现， 这给本领域的科学研究以及动物保护增 加了困难。 [0003]环境DNA检测方法的出现为鼋的检测提供了有效解决方案。 环境  DNA检测方法即 环境DNA宏条形码检测， 通过高通量测序检测分析环境DNA就能识别环境中存在 的物种种 类。 然而该方法有一定的局限性， 无法实时掌握物种的存在情况。 [0004]由此可见， 提供一种基于环境DNA的鼋现场核酸检测试剂盒及其使用方法是本领 域亟需解决的问题。 发明内容 [0005]一种基于环境DNA的鼋现场核酸检测试剂盒， 其包括引物组、 探针、 核酸检测 试纸 条、 重组酶、 聚合酶、 ddH2O、 PCR缓冲液及核酸抽提试剂盒， 所述核酸抽提试剂盒包括无菌注 射器、 集成0.45微米孔径滤的针筒式过滤器、 裂解液、 中和管、 洗涤管、 洗脱管、 磁珠、 磁棒； 所述引物组上游引物序列为： TACGCTGCAGGCCCATTCGC(5 ’ ‑3’)， 引物组下游引物序列为： TCCGGGTGAATTGTTGGTGGGA(5’ ‑3’)， 下游引物的5 ’端标记生物素Bi otin； [0006]探针的序列为： TCCCACCAACAATTCACCC GGA(5’ ‑3’)， 5’端标记FAM； 探针3 ’端标记标 记BHQ1； 核酸检测试纸条上有C线和 T线， 其中，  C线上埋有生物素抗体， T线埋有FAM基团抗 体。 [0007]一种基于环境DNA的鼋现场核酸检测试剂盒的使用方法， 其包括以下步骤： [0008]S1： 现场用无菌注射器吸取水样， 将注射器旋到针筒过滤器上， 用力推注射器让水 样全部通过针筒过 滤器， 重复该操作直到针筒过 滤器堵塞为止， 取 下无菌注射器； [0009]S2： 向针筒过滤器中加入2mL裂解液， 用手震荡针筒过滤器2min， 将针筒过滤器中 的液体吸出到装有中和液的1.5mL离心管中， 加入磁珠并上 下颠倒混匀3 ‑5次； [0010]S3： 将带磁棒套的磁棒插入离心 管中静置 1min， 待磁珠被全部吸附到磁棒后， 将磁 棒插入1mL洗涤管中， 取出磁棒， 上下颠倒混匀3 ‑5次； 将磁棒插入洗脱 管中， 取下磁棒套， 上 下颠倒混匀5 ‑10 次后静置2mi n， 待DNA充分解离后取 出带磁棒套的磁棒； [0011]S4： 向PCR扩增管中依次加入0.1 μL重组酶， 0.1 μL聚合酶， 2 μL的上游引物， 2 μL的下 游引物， 1 μL探针， 2 μL的环境  DNA， 25 μL的PCR缓冲液和17.8 μL的d dH2O；说　明　书 1/5 页 3 CN 115074448 A 3